楊欣　俆爾尼　胡冰彬

摘要 [目的]優(yōu)化脂肪酶水解菜籽油腳料的工藝，提高菜籽油腳料水解率。[方法]以菜籽油腳料為原料，選用黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料，通過單因素試驗(yàn)、BoxBenhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)該脂肪酶水解油脂的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化分析。[結(jié)果]單因素試驗(yàn)得出，黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料的最適酶添加量為200 U/ml，底物濃度75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解溫度40 ℃，酶解時(shí)間45 min以及搖床轉(zhuǎn)數(shù)150 r/min，此時(shí)菜籽油腳料水解率為16.4%。利用BoxBenhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法確定了最優(yōu)工藝條件是：酶添加量245 U/ml，底物濃度為75 mg/ml，酶解pH 7.0，酶解溫度是41 ℃，優(yōu)化后的菜籽油腳料水解率達(dá)（26.92±0.86）%。[結(jié)論]研究可為菜籽油腳料的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 菜籽油腳料；黑曲霉脂肪酶；水解反應(yīng)；水解率

中圖分類號(hào) S509.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）05-01526-04

Abstract [Objective] To optimize process conditions of hydrolysis from rapeseed oil sediment by lipase. [Method] With rapeseed oil sediment as raw material， through singlefactor experiment， BoxBenhnken compound design and response surface method， the technique conditions were optimized. [Result] The optimal condition are enzyme concentration 200 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， reaction systems pH 7.0， reaction temperature 40 ℃， reaction time 45 min and table of revolution 150 r/min， the hydrolysis of rapeseed oil sediment is 16.4%. On this base， the four major factors were optimized by using BoxBenhnken central composite orthogonal design and response surface methodology. The optimum conditions were determined as follows factors： enzyme concentration 245 U/ml， substrate concentration 75 mg/ml， pH 7.0， temperature 41 ℃， after optimization of rapeseed oil sediment to hydrolysis rate is （26.92±0.86）%. [Conclusion] The study can provide reference basis for further development and utilization of rapeseed oil sediment.

Key words Rapeseed oil sediment； Aspergillus niger lipase； Hydrolysis reaction； Hydrolysis rate

我國(guó)是世界上最大的油菜籽生產(chǎn)國(guó)，年產(chǎn)量早已突破1 000萬t，在菜籽油加工過程中，油腳料每年排放量高達(dá)20萬t。油腳料極易發(fā)酵變質(zhì)、酸敗發(fā)臭，是我國(guó)城鎮(zhèn)油廠環(huán)境污染的重要源頭[1]。菜籽油腳料中含有25%～30%的中性油，25%～35%的磷脂[2]，其余為蛋白質(zhì)、氨基酸、糖等碳水化合物，礦質(zhì)元素及色素等物質(zhì)。目前菜籽油腳料主要用來制備生物柴油、飼料、農(nóng)業(yè)肥料等[3]，而從中提取不飽和脂肪酸、甘油、磷脂等，并進(jìn)一步生產(chǎn)獲得附加值高的產(chǎn)品卻極為少見，所以油腳料的開發(fā)利用成為環(huán)境治理和生物資源再利用的重要研究課題。

脂肪酶能催化天然油脂的水解，生成脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯和甘油。其中的不飽和脂肪酸是人體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有重要的生理功能，不僅能促進(jìn)身體發(fā)育和智力增長(zhǎng)，還可調(diào)節(jié)血脂、提高免疫能力等[4]。菜籽油腳料中天然脂肪酸一般以甘油三酯形式存在，水解甘油三酯的主要方法有：硫酸法，操作過程復(fù)雜，脂肪酸質(zhì)量不穩(wěn)定[5]；堿皂化法，大量使用無機(jī)酸堿，殘留物影響產(chǎn)品質(zhì)量，產(chǎn)生的大量廢液對(duì)環(huán)境造成污染；酶催化水解法，因高效、專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，不污染環(huán)境而逐漸成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)之一[6]。

筆者通過黑曲霉脂肪酶對(duì)菜籽油腳料的水解作用，對(duì)黑曲霉脂肪酶[7-8]添加量、底物濃度、pH、溫度、時(shí)間以及搖床轉(zhuǎn)數(shù)等對(duì)水解菜籽油腳料的影響進(jìn)行單因素優(yōu)化，利用BoxBenhnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)該酶的添加量、底物濃度、pH、溫度進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化分析研究，以達(dá)到提高菜籽油腳料水解率的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 菜籽油腳料（酸價(jià)38.15，皂化值182.64），來自江西南昌。主要試劑：黑曲霉脂肪酶（酶活≥12 000 U/g），Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器：

THZC恒溫振蕩器，江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SK1快速混勻器，常州國(guó)華電器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菜籽油腳料的乳化液制備。 因?yàn)椴俗延湍_料不同于水，所以需要乳化劑來乳化菜籽油腳料形成水包油型（O/W），將底物均勻分散在反應(yīng)體系中。按照菜籽油腳料∶乳化劑=1.2∶1.0[9]配制菜籽油腳料乳化液，按比例依次加吐溫80、司班80和菜籽油腳料于50 ml三角燒瓶中，放入水浴鍋75 ℃加熱10 min，然后在混勻器上混勻8 min，之后在混勻器上邊混勻邊加入蒸餾水，混勻8 min后，在水浴鍋中加熱10 min，這樣反復(fù)加熱混勻數(shù)次，至菜籽油與水充分混勻?yàn)橹?。再?21 ℃，30 min水解處理，備用。

1.2.2 脂肪酶水解菜籽油腳料的方法及水解率的測(cè)定。

因?yàn)橹久杆獠俗延湍_料反應(yīng)為可逆反應(yīng)，脂肪酶在酯水解和酯化反應(yīng)中做催化劑用。一般在含百分之幾十水的反應(yīng)體系中進(jìn)行水解反應(yīng)，若含水量控制在20%以內(nèi)則優(yōu)先進(jìn)行酯化反應(yīng)；反應(yīng)混合物中含水量為70%～90%時(shí)，則脂肪酶進(jìn)行的幾乎全為水解反應(yīng)[10]。

取一定量的菜籽油腳料乳化液于150 ml的錐形瓶中，加入適量的黑曲霉脂肪酶，然后加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，置于搖床培養(yǎng)箱中，在一定溫度下，經(jīng)一段時(shí)間酶解后，立刻加入50 ml醇醚混合溶液終止反應(yīng)，用堿滴定法滴定，測(cè)得酸價(jià)，并做空白對(duì)照[11]。

1.2.3.5 酶解時(shí)間對(duì)酶水解油脂的影響。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的錐形瓶中加入pH為7.0的緩沖液，加入黑曲霉脂肪酶200 U/ml， 40 ℃，100 r/min分別搖床0、30、45、60、120、240、360 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用堿滴定法滴定，比較不同酶解時(shí)間對(duì)菜籽油腳料水解率的影響。

1.2.3.6 不同搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)酶水解油脂的影響。

取75 mg/ml的菜籽油乳化液3 ml于150 ml的錐形瓶中加入pH為7.0的緩沖液，加入黑曲霉脂肪酶為200 U/ml，40 ℃，分別在轉(zhuǎn)數(shù)為80、100、120、150、200 r/min搖床45 min后，取出，加入50 ml醇醚混合溶液，用堿滴定法滴定，比較不同振蕩轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)酶促菜籽油腳料水解率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化水解工藝。

根據(jù)各單因素試驗(yàn)的結(jié)果，采用BoxBehnken設(shè)計(jì)數(shù)學(xué)模型[14]，選擇對(duì)黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料有顯著影響的4個(gè)因素，即pH、溫度、底物濃度、酶添加量為自變量，以菜籽油腳料水解率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)出4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，如表1。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)通過對(duì)黑曲霉脂肪酶水解菜籽油腳料的工藝條件進(jìn)行研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Design expert 軟件BoxBenhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)黑曲霉脂肪酶水解菜油腳料的酶添加量、底物濃度、pH、溫度做了進(jìn)一步優(yōu)化研究，確定了最優(yōu)酶添加量是245 U/ml，底物濃度為75 mg/ml，pH 7.0，酶解溫度41 ℃。在此優(yōu)化條件下，菜籽油腳料水解率為（26.92±0.86）%。

通過堿滴定法滴定酶水解菜油腳料體系中的游離脂肪酸，得出酸價(jià)；根據(jù)菜籽油腳料本身的酸價(jià)和皂化值，通過公式算出酶解菜油的水解率，但因?yàn)樗怏w系中含有緩沖液，且乳化液的顏色會(huì)干擾滴定終點(diǎn)的判斷，使得該方法重現(xiàn)性不夠理想，今后應(yīng)該對(duì)該方法的反應(yīng)體系進(jìn)行探索，找出一種方法使得測(cè)定方法確定性高，重現(xiàn)性好。

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