董明勤，劉 飆，劉 燕，李文剛，李中秋

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院）

ChAT表達(dá)激活劑的篩選及其機(jī)制研究

董明勤1，劉 飆1，劉 燕1，李文剛1，李中秋2＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院）

目的利用ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)中藥小分子化合物進(jìn)行篩選，以期找到能夠促進(jìn)ChAT表達(dá)的化合物。方法用構(gòu)建的ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告體系從400余種中藥小分子化合物中篩選ChAT啟動(dòng)子激活劑，并用RT－PCR和Western Blot方法對(duì)篩選得到的小分子化合物進(jìn)行驗(yàn)證。利用免疫印跡法分析篩選得到的化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響。結(jié)果通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)大豆甙元能夠激活ChAT啟動(dòng)子的活性，與對(duì)照相比具有顯著性差異（P＜0.05）。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，大豆甙元也可以促進(jìn)ChAT mRNA和蛋白的表達(dá)。另外，大豆甙元能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化，并進(jìn)而激活ERK／MAPK信號(hào)通路。結(jié)論大豆甙元能夠促進(jìn)ChAT基因的表達(dá)，并引起細(xì)胞內(nèi)ERK／MAPK信號(hào)通路的改變。

大豆甙元；藥物篩選；ChAT；神經(jīng)干細(xì)胞；ERK／MAPK信號(hào)通路

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1576）

乙酰膽堿（ACh）已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）調(diào)節(jié)著不同的生理功能，包括認(rèn)知、注意力和覺(jué)醒等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)元的機(jī)能失調(diào)也與年齡相關(guān)的記憶障礙、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病相關(guān)［1］。乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（ChAT）是膽堿能神經(jīng)元遞質(zhì)乙酰膽堿合成的限速酶［2］。早期的觀點(diǎn)認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)法進(jìn)行自我更新和修復(fù)是因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)內(nèi)不存在干細(xì)胞。直到Randon等學(xué)者提出神經(jīng)干細(xì)胞的概念，他們從小鼠海馬區(qū)域分離出可以增殖、分裂，并具有多項(xiàng)潛能的神經(jīng)干細(xì)胞［3］。目前，神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化研究已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的熱點(diǎn)。隨著神經(jīng)干細(xì)胞研究的迅速發(fā)展，神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和移植治療神經(jīng)損傷及退行性疾病也逐漸成為可能。那么，在體內(nèi)外研究定向分化的機(jī)制、尋找治療靶點(diǎn)、開(kāi)發(fā)新的治療藥物，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的重點(diǎn)問(wèn)題。鑒于ChAT是膽堿能神經(jīng)的重要標(biāo)志物，本研究以ChAT啟動(dòng)子為靶點(diǎn)，對(duì)小分子化合物庫(kù)進(jìn)行篩選，以期發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)ChAT基因表達(dá)的小分子化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DMEM購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；DEPC購(gòu)自Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金公司；熒光素購(gòu)自BD Monolight TM公司，ONPG購(gòu)自上海生物工程公司；ERK1／2和p－ERK1／2的抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；ChAT抗體購(gòu)自Millipore公司；抗GAPDH抗體購(gòu)自上?？党缮镉邢薰?。

1.1.2 細(xì)胞與質(zhì)粒 人胚胎腎細(xì)胞293T（HEK293T）及小鼠畸胎瘤細(xì)胞（P19）購(gòu)自上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)并由實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將P19細(xì)胞用含10%胎牛血清、100μg／ml鏈霉素、100μg／ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞傳代時(shí)，用DMEM或D－Hanks緩沖液清洗細(xì)胞以除去培養(yǎng)基和血清，隨后用0.25%的胰蛋白酶溶液（含有0.2%EDTA）消化細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化時(shí)，用移液器將胰蛋白酶溶液小心地吸出，再加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打至完全脫落，并按照一定比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前一天將P19細(xì)胞以1×105／孔的比例接種到24孔細(xì)胞板中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前長(zhǎng)到80%左右；次日將ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染入P19細(xì)胞（步驟參見(jiàn)Invitrogen的LipofectamineTM2000）中，轉(zhuǎn)染時(shí)為了減少誤差，同時(shí)將pCMV－β－gal質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染。48h后取出細(xì)胞，棄去舊的培養(yǎng)基，每孔中加入100μl細(xì)胞裂解液，置于冰上30min。在96孔白板中加入5μl的Assay cocktail，再加入45μl細(xì)胞裂解液及100μl檢測(cè)液，立即用熒光化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定熒光素酶的活性；另取出20μl細(xì)胞裂解液置于酶標(biāo)板中，加入β－半乳糖苷酶（β－gal）活性檢測(cè)液50μl至液體變黃，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值，并用此值來(lái)標(biāo)化熒光素酶活性值，從而修正由于轉(zhuǎn)染效率的差異而引起的誤差。

1.2.3 化合物的篩選 利用ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)室中藥庫(kù)中400多種中藥單體及中藥有效組分進(jìn)行初步篩選。用ChAT啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，加入中藥化合物（化合物終濃度為5μg／ml）繼續(xù)培養(yǎng)8－12h后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.2.4 RNA提取與RT－PCR 將待提取RNA的細(xì)胞取出，用TRIzol法提取RNA（步驟參見(jiàn)Invitrogen產(chǎn)品說(shuō)明），逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增（步驟參見(jiàn)北京全式金公司產(chǎn)品），將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。RT－PCR引物見(jiàn)表1。

1.2.5 蛋白質(zhì)提取與Western Blot 將大豆甙元（終濃度為5μg／ml）處理24h的細(xì)胞取出，提取蛋白、SDS－PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜2h、封閉后用TBST漂洗，加入稀釋相應(yīng)濃度的第一抗體，4℃孵育過(guò)夜后多次漂洗，標(biāo)記第二抗體。孵育1h后漂洗，顯影分析。

表1 RT－PCR引物

2 結(jié)果

2.1 ChAT基因轉(zhuǎn)錄激活劑的篩選

用以ChAT啟動(dòng)子為靶點(diǎn)的篩選模型對(duì)400余種小分子化合物進(jìn)行篩選，通過(guò)檢測(cè)ChAT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶的活性來(lái)判斷化合物對(duì)ChAT啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果如圖1所示，大豆甙元（daidzein）對(duì)ChAT啟動(dòng)子具有明顯的激活作用，與對(duì)照相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異（＊P＜0.05）。

圖1 Daidzein對(duì)ChAT啟動(dòng)子活性的影響

2.2 Daidzein對(duì)ChAT mRNA和蛋白表達(dá)的影響

鑒于Daidzein具有激活ChAT啟動(dòng)子的作用。我們進(jìn)一步通過(guò)RT－PCR和免疫印跡法檢測(cè)了Daidzein對(duì)ChAT mRNA和蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖2及3所示，Daidzein同樣可以促進(jìn)ChAT－mRNA和蛋白的表達(dá)。

圖2 Daidzein對(duì)ChAT mRNA表達(dá)的影響

圖3 Daidzein對(duì)ChAT蛋白表達(dá)的影響

2.3 Daidzein對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的影響

為了研究Daidzein對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路的影響，我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)了Daidzein對(duì)ERK／MAPK信號(hào)通路的影響。結(jié)果如圖4所示，Daidzein可促進(jìn)ERK1／2的磷酸化，說(shuō)明Daidzein可激活ERK／MAPK信號(hào)通路，提示Daidzein促進(jìn)ChAT基因的表達(dá)可能與其激活ERK／MAPK信號(hào)有關(guān)。

圖4 Western blot檢測(cè)Daidzein對(duì)ERK／MAPK信號(hào)的影響

3 討論

膽堿能神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，參與學(xué)習(xí)、記憶、睡眠等生理功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能神經(jīng)元的機(jī)能失調(diào)也與年齡相關(guān)的記憶障礙、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病相關(guān)［4］。自從Randon等分離出神經(jīng)干細(xì)胞之后，神經(jīng)再生的研究成為了生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［1］。也使神經(jīng)干細(xì)胞的移植及定向誘導(dǎo)分化成為可能。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，激活素和bFGF能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為ChAT陽(yáng)性細(xì)胞和TH陽(yáng)性細(xì)胞［5］。但是激活素和bFGF均為細(xì)胞因子，成本較高，且容易失活，因此尋找更加低廉、穩(wěn)定的神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑仍是生命科學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)問(wèn)題。鑒于ChAT是膽堿能神經(jīng)的重要標(biāo)志物，本研究以ChAT啟動(dòng)子為靶點(diǎn)建立篩選模型，對(duì)中藥小分子化合物庫(kù)中的化合物進(jìn)行篩選，以期發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)進(jìn)行分化的中藥化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Daidzein對(duì)ChAT基因的轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用，此作用進(jìn)一步通過(guò)RT－PCR和免疫印跡得到證實(shí)。

本研究應(yīng)用的啟動(dòng)子水平篩選模型從基因表達(dá)調(diào)控出發(fā)，針對(duì)某一特定的靶點(diǎn)進(jìn)行藥物篩選，有更好的專一性、效率更高、篩選范圍更廣，避免了以往動(dòng)物水平篩選和組織水平篩選的劣勢(shì)。但是這僅僅是初步的研究，如何從細(xì)胞，分子水平的篩選過(guò)度到臨床試驗(yàn)，還有很長(zhǎng)的路要走［6］。

ERK／MAPK是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的通路，可通過(guò)促進(jìn)某些基因表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖及分化［7］。ERK是ras絲裂原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的核心元件，ERK被激活后可進(jìn)入核內(nèi)，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，如ERK促進(jìn)血清反應(yīng)因子（SRF）磷酸化，并結(jié)合含有血清反應(yīng)元件（SRE）的靶基因啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性［9］。本研究通過(guò)Western blot分析發(fā)現(xiàn)，中藥化合物大豆甙元能夠促進(jìn)ERK的磷酸化，進(jìn)而激活ERK／MAPK信號(hào)通路。提示Daidzein促進(jìn)ChAT基因的表達(dá)可能與其激活ERK／MAPK信號(hào)有關(guān)，但尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去證明。本研究為進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)膽堿能神經(jīng)分化誘導(dǎo)劑奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Screening of ChAT gene expression modulators from Small－molecule Compounds and study of the modulation mechanisms

DONG Ming－qin，LIU Biao，LIU Yan，et al.（China Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveScreening of ChAT gene expression activator from traditional Chinese medicine compounds library.MethodsScreening of ChAT gene expression activator from over 400compounds by using ChAT gene promoter driven luciferase reporter system，then investigated the compound effect on the expression of ChAT mRNA and pretein by RT－PCR and western blot.The effect of compounds on intracellular signaling pathway was study by western blot.ResultsDaidzein was found that can promote the activity of ChAT promoter（P＜0.05），and further increase the ChAT expression in both mRNA and protein levels.In addition，Daidzein can promote ERK1／2phosphorylation and activite the ERK／MAPK signaling pathway.ConclusionDaidzein can promote the expression of ChAT gene，and activite the ERK／MAPK signaling pathway.

Daidzein；compound screening；ChAT；neural stem cells；ERK／MAPK signaling pathway

Q786

A

2014－01－11）

1007－4287（2014）10－1576－03

＊通訊作者