趙 鑫，劉玉俠，常 穎，王啟文＊，盧衛(wèi)平，王 寶，段北野

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

抗原負(fù)載的樹突狀細(xì)胞對(duì)食管鱗癌細(xì)胞體外殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

趙 鑫1，劉玉俠2，常 穎1，王啟文1＊，盧衛(wèi)平1，王 寶1，段北野2

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

近年來(lái)，生物治療由于它抗腫瘤的獨(dú)特特點(diǎn)，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DC）作為腫瘤生物治療中的一種，近年來(lái)研究的比較多，尤其在遞呈抗原抗腫瘤方面。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抗原負(fù)載的DC對(duì)食道癌細(xì)胞體外殺傷作用進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料淋巴細(xì)胞分離液（比重1.078）購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4購(gòu)于Peprotech公司；IMDM培養(yǎng)基購(gòu)于賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；胎牛血清購(gòu)于北京元亨；MTT購(gòu)于Sigma公司。Ecap－109細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.2 外周血單核細(xì)胞的分離用淋巴細(xì)胞分離液（比重1.078）分離人外周血單核細(xì)胞，然后將分離的外周血單核細(xì)胞用含10%FCS的IMDM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為1×106／ml，放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 樹突狀細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)以上分離的單核細(xì)胞培養(yǎng)1天后，進(jìn)行細(xì)菌污染檢測(cè)后，加入細(xì)胞因子GM－CSF100ng／ml，IL－4 50ng／ml，TNF－α10 ng／ml，37℃，5%CO2條件下在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3天半量換液并補(bǔ)加細(xì)胞因子，誘導(dǎo)DC生成。

1.4 Ecap－109細(xì)胞抗原的制備用含10%FCS的IMDM的培養(yǎng)液培養(yǎng)人食道鱗癌細(xì)胞Ecap－109至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化后，放入恒溫水浴箱，43℃，2h進(jìn)行熱休克，結(jié)束后用超聲細(xì)胞破碎儀破碎30min，15 000rpm，離心1h，取上清作為腫瘤抗原。

1.5 抗原濃度測(cè)定用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取抗原的OD值，用下列公式計(jì)算抗原濃度：抗原（蛋白）濃度（mg／ml）＝1.45×OD280－0.74× OD260。

1.6 腫瘤抗原負(fù)載DC將提取的腫瘤抗原（20 μg／ml）與培養(yǎng)6天的DC共同培養(yǎng)，3天后進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)。

1.7 抗原負(fù)載的DC及DC對(duì)Ecap－109細(xì)胞殺傷活性實(shí)驗(yàn)

1.7.1 復(fù)蘇、培養(yǎng)Ecap－109細(xì)胞 將Ecap－109細(xì)胞從液氮中取出，復(fù)溫，洗滌后，用含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)Ecap－109細(xì)胞至指數(shù)生長(zhǎng)期，然后用0.25%胰酶消化，用IMDM培養(yǎng)液洗滌后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)為5×104／ml，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl。

1.7.2 將培養(yǎng)的DC、抗原負(fù)載的DC計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)為1.25×106／ml，按以下設(shè)計(jì)加入到已經(jīng)加入Ecap－109細(xì)胞并貼壁的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，效應(yīng)細(xì)胞（DC、抗原負(fù)載的DC細(xì)胞）與靶細(xì)胞（Ecap－109）的比例為25∶1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6復(fù)孔，培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h加入MTT（5μg／ml），20μl／孔。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去培養(yǎng)板中的上清，每孔加150μl DMSO，振蕩混勻，上酶標(biāo)儀測(cè)OD值（492nm）。實(shí)驗(yàn)分組：①DC對(duì)照；②DC＋Ag對(duì)照；③DC＋Ecap－109；④DC＋Ag＋Ecap－109；⑤Ecap－109對(duì)照。

1.8 殺傷活性計(jì)算公式100%。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS V16.0軟件，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

負(fù)載抗原的DC以及DC對(duì)人食道癌細(xì)胞株Ecap－109的殺傷作用，見表1。從表中抗原看出，負(fù)載抗原的DC對(duì)Ecap－109的殺傷作用明顯高于未負(fù)載抗原的DC（P＜0.01）。

表1 負(fù)載抗原的DC以及DC對(duì)人食道癌細(xì)胞株Ecap－109的殺傷作用

3 討論

食道鱗癌的治療以手術(shù)切除為主，輔以化療和放療，但其遠(yuǎn)期療效仍不理想。ESCC患者就診時(shí)多已發(fā)展為晚期，手術(shù)難以完全切除，而放、化療不僅對(duì)造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等產(chǎn)生嚴(yán)重毒性作用，最終還可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。近年來(lái)腫瘤生物治療已經(jīng)成為腫瘤治療的一種新手段，以DC疫苗活化CTL發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫治療取得了初步成果［1－3］，這對(duì)食道鱗癌的治療具有深遠(yuǎn)的意義。

生物治療的細(xì)胞有很多種，包括20世紀(jì)80年代初的LAK細(xì)胞，TIL細(xì)胞以及發(fā)展到現(xiàn)在的NK細(xì)胞，γδT細(xì)胞，T細(xì)胞，CIK細(xì)胞，DC細(xì)胞等，它們的作用原理相同，但是作用機(jī)制及效果不盡相同。樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cells，DC）作為腫瘤生物治療中的一種，近年來(lái)研究的比較多，尤其在遞呈抗原抗腫瘤方面［4－6］，并且都得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)抗原負(fù)載的DC對(duì)食道癌細(xì)胞體外殺傷作用的研究，尋找一種對(duì)食道鱗癌細(xì)胞有效的生物治療方法，為食道鱗狀細(xì)胞癌的治療提供一種新的治療手段。

DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，它能攝取、加工和遞呈腫瘤抗原，促使細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）和T輔助細(xì)胞（Th）發(fā)揮抗腫瘤作用。

TIDC（tumor infiltrating dendritic cell）是浸潤(rùn)至腫瘤及其附近轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)的樹突狀細(xì)胞，它的數(shù)量和功能可以反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)［7］，食道癌組織中CD1α和CD83的表達(dá)低于正常黏膜組織，而CD1α是DC的特異標(biāo)志，CD83是DC成熟的標(biāo)志，說(shuō)明食道癌組織DC的表達(dá)低于正常食道黏膜組織，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的DC數(shù)目少于正常淋巴結(jié)，表明食道鱗癌患者機(jī)體全身或局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中免疫能力下降，也說(shuō)明DC在抗腫瘤免疫中的重要作用。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一個(gè)大的蛋白質(zhì)家族，在細(xì)胞中起分子伴侶作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，這一家族除了具有重要的分子伴侶功能外，還參與細(xì)胞抗損傷、分化等作用，其中的HSP70在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。HSP70可以與抗原肽結(jié)合并能夠?qū)⑴c其結(jié)合的抗原多肽通過(guò)內(nèi)源性途徑傳遞給MHC I類分子，引起特異性的T細(xì)胞活化，發(fā)揮抗腫瘤作用［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外誘導(dǎo)DC生成，并用熱休克方法提取的熱休克蛋白70－抗原肽作為抗原，與DC共同培養(yǎng)，對(duì)食道鱗癌細(xì)胞Ecap－109進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)研究，證明無(wú)論是DC還是負(fù)載抗原的DC對(duì)Ecap－109均有較強(qiáng)的殺傷作用，其中負(fù)載抗原的DC對(duì)Ecap－109具有更強(qiáng)的殺傷作用（P＜0.01），證明從食道鱗癌細(xì)胞Ecap－109中提取的熱休克蛋白70抗原肽可以作為腫瘤抗原增強(qiáng)DC的抗腫瘤功能。

［1］楊靜悅，曹大勇，劉文超，等.L－18基因增強(qiáng)腫瘤抗原致敏DC誘導(dǎo)的CTL特異性殺傷肝癌細(xì)胞［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009，16（1）55.

［2］Gilboa E.DC－based cancer vaccines［J］J Clin Invest，2007，117（5）：1195.

［3］Curti A，Tosi P，Comoli P.et al.Phase I／II clinical trial of sequential subcutaneous and intravenous delivery of dendritic cell vaccination for refractory multiple myeloma using patient specific tumor idiotype protein or idiotype（VDJ）－derived class I restricted peptides［J］.Br J haematol，2007，139（3）：415.

［4］趙立波，李 才，周維國(guó)，等.樹突狀細(xì)胞負(fù)載的腫瘤抗原肽疫苗抗腦膠質(zhì)瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13（1）：21.

［5］劉玉俠，于 鴻，張振武，等.熱休克蛋白70激發(fā)樹突狀細(xì)胞抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（12）：1969.

［6］盧衛(wèi)平，賈春祎，王啟文，等.HSP70－抗原肽負(fù)載的DCs對(duì)肺癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2011，11（24）：5807.

［7］王 雷，單保恩，劉 亮，等.食管鱗癌和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織中CD1α和CD83的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2009，16（4）：401.

［8］Nair SK，Synder D，Rous BT，et al.Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen－presenting cells pulsed with tumor extracts［J］.Int J Cancer，1997，70：706.

2013－09－28）

1007－4287（2014）10－1599－02

＊通訊作者