于坤坤，劉 毅，張 坤，李 棟，馬衍輝＊

（1.泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東泰安271000；2.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，山東濟(jì)南250022）

高分辨率熔解曲線法檢測CBS基因SNP的技術(shù)優(yōu)化

于坤坤1，劉 毅2，張 坤2，李 棟1，馬衍輝2＊

（1.泰山醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，山東泰安271000；2.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院，山東濟(jì)南250022）

目的探索高分辨率熔解曲線法（high resolution melting，HRM）檢測胱硫醚β－合酶（CBS）基因SNP位點所需的最佳反應(yīng)體系和條件，建立快速高效的對CBS基因分型的方法。方法通過普通PCR初步確立引物的退火溫度范圍，在實時熒光定量PCR（qPCR）－HRM反應(yīng)中調(diào)整確定最佳退火溫度。對影響qPCR－HRM的因素包括反應(yīng)程序、模板DNA、MgCl2再分別進(jìn)行優(yōu)化，確立最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，對在此基礎(chǔ)上得出的基因分型結(jié)果通過測序驗證其準(zhǔn)確性，從而建立系統(tǒng)的HRM檢測CBS基因SNP的方法。結(jié)果HRM檢測CBS基因該片段最佳退火溫度為62℃，qPCR－HRM最佳反應(yīng)體系為20μl，引物濃度為0.2μmol／L，Mg2＋為2.5μmol／L，模板DNA為60ng。在優(yōu)化的體系條件下篩選出的突變型樣本經(jīng)測序驗證與實驗結(jié)果一致。結(jié)論HRM可以作為檢測SNP準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效的方法。

高分辨率熔解曲線；單核苷酸多態(tài)性；胱硫醚β－合酶

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1603）

高分辨率熔解曲線（High Resolution Melting，HRM）技術(shù)是近年來興起的一種新的SNP及突變研究工具。該技術(shù)是2002年由猶他大學(xué)和愛德華科技公司合作開發(fā)的應(yīng)用于SNP檢測分析的一項新技術(shù)。其主要原理是在實時熒光定量PCR基礎(chǔ)上通過飽和熒光染料監(jiān)控核酸的熔解曲線變化而檢測基因某片段是否存在SNP位點或突變，進(jìn)行基因分型。HRM因其低成本、高通量、快速準(zhǔn)確的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域［1］。

CBS基因編碼胱硫醚β－合酶，該酶是葉酸／同型半胱氨酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，其異常可能導(dǎo)致同型半胱氨酸在體內(nèi)蓄積，是很多先天性疾病的危險因素。近年來，一些葉酸／同型半胱氨酸代謝通路中酶的編碼基因的多態(tài)性與先天性心臟病的關(guān)系被廣泛研究和報道，主要集中于一些基因外顯子的SNP位點，如MTHFR基因rs1801131、rs1801133［2，3］，MTRR基因rs1801394、rs1532268［4］，此外Zhao等［5，6］研究發(fā)現(xiàn)在MTRR、CBS基因內(nèi)含子中的兩個SNP位點（rs326119、rs2850144）與先心病存在相關(guān)性。

本研究旨在建立檢測CBS基因多態(tài)性位點的qPCR－HRM方法，并將其用于臨床標(biāo)本的檢測，與測序結(jié)果比較，初步探討該方法的臨床應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2012年11月到2013年5月于山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院心血管科明確診斷為先天性心臟病的患兒為病例組，共69例（男36例，女33例，年齡1月－7歲；隨機(jī)選取門診及住院的健康非先心病兒童為對照組，共62例（男45例，女17例）年齡3天－7歲。收集枸櫞酸鈉抗凝外周血標(biāo)本，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

血液基因組DNA提取試劑盒（DP318－02，天根生物技術(shù)有限公司，北京），PCR儀（PTC－200，BIORAD，德國），瓊脂糖凝膠電泳儀（Tanon EPS300，上海天能科技有限公司，上海），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500，上海天能科技有限公司，上海），紫外分光光度計（EPPENDOFF6131，Eppendorf，德國），熒光定量PCR儀（Light－Cycler480Ⅱ，Roche，瑞士），High Resolution Melting Master試劑盒（Light－Cycler480，Roche，瑞士）。

1.3 引物的設(shè)計與合成

從NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫中查詢CBS基因序列信息，運用在線軟件Primer3Input設(shè)計正反向引物，用BLAST檢驗其特異性，結(jié)果良好。引物由上海博尚生物有限公司合成，HPLC純化。序列如下：

1.4 基因組DNA的提取

對抗凝血標(biāo)本，采用血液全基因組DNA提取試劑盒提取DNA，以30μl TE緩沖液溶解，紫外分光光度計測量并記錄其濃度，將標(biāo)本－20℃保存。具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.5 普通溫度梯度PCR

在進(jìn)行qPCR－HRM之前首先以對照組DNA為模板，通過普通溫度梯度PCR對退火溫度的范圍進(jìn)行摸索，將模板DNA稀釋至40ng／μl，引物濃度為10μmol／μl，根據(jù)引物Tm值，將退火溫度設(shè)置6個梯度，從低到高依次為57℃、58.2℃、60.1℃、61.2℃、62.2℃、63.5℃。PCR體系為25μl，包括2.5μl 10×PCR buffer，2μl dNTP（2.5mmol／L），各1μl正反向引物（10μmol／L），1μl模板DNA（40 ng／μl），0.2μl Taq酶，其余水補足。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s；35個循環(huán)；72℃延伸5min。產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳40mim，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，根據(jù)電泳條帶的清晰度和特異性確定退火溫度范圍，選取不同的退火溫度進(jìn)行qPCR－HRM反應(yīng)，根據(jù)熔解曲線進(jìn)一步優(yōu)化確定最佳退火溫度范圍。

1.6 qPCR－HRM模板量的優(yōu)化

將DNA模板濃度稀釋為10ng／μl，在qPCRHRM反應(yīng)體系中將模板量設(shè)置為以下梯度：10 ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果綜合其他影響因素選擇最佳模板量。

1.7 qPCR－HRM退火溫度與Mg2＋濃度的確定

通過普通PCR反應(yīng)結(jié)果，選擇58℃、62℃為退火溫度分別進(jìn)行qPCR－HRM，反應(yīng)使用羅氏HRM Master試劑盒，選擇20μl體系，其中HRM Master Mix10μl、4μmol／L的正反向引物各1μl，Mg2＋濃度參考羅氏HRM Master說明書，選擇兩個值1.0 mmol／L、2.5mmol／L，對應(yīng)加液體積為0.8μl、2.0 μl，模板量按梯度加入，不足水補。qPCR－HRM分析按以下循環(huán)參數(shù)在LightCycler480上進(jìn)行：95℃預(yù)變性10min；95℃10s變性，15s退火，72℃10s延伸，45個循環(huán)；擴(kuò)增后高分辨率熔解曲線分析：95℃1 min，40℃1min，65℃1s，以0.02℃／s的速度升溫到95℃（連續(xù)監(jiān)測熒光，每秒檢測25次）；40℃1s冷卻。反應(yīng)結(jié)束后通過LightCycler480SW1.5.0軟件中的Tm calling和Gene Scaning進(jìn)行突變分析。

2 結(jié)果

2.1 普通PCR確定引物退火溫度范圍

普通PCR經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段為205bp，結(jié)果如圖1，顯示從57.0℃－63.5℃，六個溫度梯度，均有特異性擴(kuò)增，清晰度最高的是泳道5、6。

圖1 溫度梯度PCR電泳結(jié)果

2.2 qPCR－HRM模板量的優(yōu)化

在設(shè)置的10－60ng模板量梯度反應(yīng)中，50ng、60ng擴(kuò)增效果及熔解曲線較為良好（如圖2，A1A2、B1B2）。選取60ng為最佳DNA模板量，擴(kuò)增曲線及熔解峰特異性最優(yōu)。

2.3 qPCR－HRM退火溫度與Mg2＋濃度的確定

在qPCR－HRM反應(yīng)中對退火溫度及Mg2＋濃度進(jìn)一步優(yōu)化，在適宜的模板量下，62℃退火溫度較58℃熔解峰型單一，特異性更好（如圖2，A2、B2）。Mg2＋濃度1.0mmol／L與2.5mmol／L，后者在62℃退火溫度、模板量60ng可使反應(yīng)達(dá)到優(yōu)化效果（如圖2，C1C2、D1D2），因此確定Mg2＋最佳濃度為2.5mmol／L。

圖2 qPCR－HRM退火溫度、Mg2＋濃度、模板量的優(yōu)化

2.4 HRM檢測CBS基因多態(tài)性

以經(jīng)過測序的野生型DNA樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，HRM分析檢測CBS基因目的片段，結(jié)果如圖3，紅色曲線代表的樣品為突變型，將本樣品進(jìn)行測序驗證，測序峰圖證實為突變型，為C→T雜合突變（圖4）。本研究檢測病例組69例，對照組62例，兩組基因及基因型頻率分布見表1。

圖3 qPCR－HRM基因分型分析結(jié)果曲線注：HRM樣品基因分型曲線，紅色曲線代表突變型樣品。

圖4 測序結(jié)果注：紅色箭頭示突變型

表1 病例組和對照組基因型和等位基因頻率分布

3 討論

目前存在的檢測基因突變或SNP的方法很多，包括測序、Taqman探針法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、變性高效液相色譜法、寡核苷酸鏈連接分析、HRM等。探針法速度快通量大，但價格較為昂貴，寡核苷酸鏈連接分析因為可操作性差等原因沒有普及開來，其他方法也因成本高通量低等缺點限制了其廣泛使用。而HRM分析法因成本低，操作簡便，靈敏度高而成為當(dāng)前較為流行的一種檢測突變或SNP的新方法。該技術(shù)不需要探針，只需在反應(yīng)中加入飽和熒光染料，在一定溫度范圍內(nèi)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，在同一個平臺上進(jìn)行基因分型和突變掃描，繪制溫度熔解曲線，并據(jù)之區(qū)分野生型和突變型。整個過程閉管操作，也降低了污染的可能。

在HRM反應(yīng)中，反應(yīng)條件和體系對結(jié)果具有直接影響。包括引物的特異性和濃度、退火溫度、反應(yīng)程序、模板的濃度以及Mg2＋濃度。退火溫度過低，特異性差；溫度過高則影響其和模板的結(jié)合，降低了擴(kuò)增的效率。本研究通過普通溫度梯度PCR初步確定了引物退火溫度范圍，進(jìn)一步在qPCRHRM反應(yīng)中確定了最佳退火溫度為62℃，該溫度的電泳條帶也顯示清晰明亮。反應(yīng)程序按照羅氏HRM Master說明書推薦程序。對于模板及Mg2＋濃度的選擇，模板的濃度直接影響擴(kuò)增及反應(yīng)特異性，而Mg2＋是TaqDNA聚合酶活性所必需的，過低影響活性，過高則使反應(yīng)特異性降低。此外各組分之間也相互影響，如模板濃度過高會和Mg2＋螯合影響到TaqDNA聚合酶［7］。本研究分別對模板量及Mg2＋濃度設(shè)置多個值，從實驗結(jié)果曲線分析，模板量以60ng，Mg2＋2.5mmol／L的濃度最佳。

本研究通過對影響qPCR－HRM反應(yīng)的多個因素進(jìn)行優(yōu)化，成功地建立了用高分辨率熔解曲線檢測分析CBS基因片段SNP位點的方法，為該位點大樣本篩查提供基礎(chǔ)，同時為其他基因的HRM檢測提供借鑒。

［1］Marotta RV，Turri O，Morandi A，et al.High resolution melting analysis to genotype the most common variants in the HFE gene［J］.Clin Chem Lab Med，2011，49（9）：1453.

［2］Hobbs CA，Cleves MA，Karim MA，et al.Maternal Folate－Related Gene Environment Interactions and Congenital Heart Defects［J］.Obstet Gynecol，2010，116（2Pt 1）：316.

［3］Lupo PJ，Goldmuntz E，Mitchell LE.Gene－gene interactions in the folate metabolic pathway and the risk of conotruncal heart defects［J］.J Biomed Biotechnol，2010，2010：630940.

［4］Zeng W，Liu L，Tong Y，et al.A66Gand C524Tpolymorphisms of the methionine synthase reductase gene are associated with congenital heart defects in the Chinese Han population［J］.Genet Mol Res，2011，25，10（4）：2597.

［5］Zhao JY，Yang XY，Gong XH，et al.Functional Variant in Methionine Synthase Reductase Intron－1Significantly Increases the Risk of Congenital Heart Disease in the Han Chinese Population［J］.Circulation，2012，125（3）：482.

［6］Zhao JY，Yang XY，Shi KH，et al.A functional variant in the cystathionineβ－synthase gene promoter significantly reduces congenital heart disease susceptibility in a Han Chinese population［J］.Cell Res，2012，Sep 18.［Epub ahead of print］

［7］劉麗琴，張海燕，王 捷.KRAS基因突變高分辨率熔解曲線檢測技術(shù)參數(shù)的優(yōu)化［J］.中國實驗診斷學(xué)，2012，16（7）：1167.

The Optimization of High Resolution Melting Analysis for SNP of CBS Gene Detection

YU Kun－kun1，LIU Yi2，ZHANG

Kun，et al.（1.School of Health TaiShan Medical University，Taian 271000，China；2.Qilu Children’s Hospital of Shandong University，Jinan250022，China）

ObjectiveTo explore the optimal reaction condition of high resolution melting（HRM）for detecting SNPs of Cystathionine Beta Synthetase（CBS），and establish the fast and effective way of genotyping.MethodsThe annealing temperature range was firstly determined by common polymerase chain reaction，then optimal annealing temperature was adjusted by qPCR－HRM.The qPCR－HRM reaction system，including reaction process，DNA template，and MgCl2concentration，were optimized to obtain the best result.Finally，the genotyping results were varified by Sanger sequencing.In this way，the qPCR－HRM of detecting CBS SNP was established.ResultsThe optimal annealing temperature was 62℃；the best reaction system of qPCR－HRM includs primers 0.2μmol／L，Mg2＋2.5μmol／L，and DNA template 60ng in 20μl.The results of HRM and direct sequencing were consistent.ConclusionHRM could serve as an accurate，fast，and effective method for detecting SNPs of genes.

high resolution melting（HRM）；SNP；Cystathionine Beta Synthetase（CBS）

R446.7

A

于坤坤（1987－），男，山東省濟(jì)寧市人，泰山醫(yī)學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)碩士研究生在讀。

2013－08－27）

山東省自然科學(xué)基金（ZR2011HM018）；山東省大學(xué)生學(xué)術(shù)課題（13CER013）

＊通訊作者