陳長卿+李桐+李欣蓮+姜云+田磊+許鵬

[收稿日期] 2013-10-22

[基金項目] 吉林省科技廳重點科技攻關(guān)項目（20140204055NY）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201310193001）

[通信作者] *陳長卿，副教授，研究方向為藥用植物病害生物防治，E-mail：ccqjy@163.com

[摘要] 為明確人參內(nèi)生生防細(xì)菌NJ13在宿主體內(nèi)的定殖特性，該研究通過抗生素誘導(dǎo)獲得了同時對利福平和硫酸鏈霉素具有穩(wěn)定抗性的雙抗標(biāo)記菌株NJ13-R，分析了菌株在宿主體內(nèi)的定殖特性，并研究了NJ13對人參黑斑病的田間防治效果。結(jié)果表明，菌株在人參根、莖、葉部均可定殖，而且定殖量與接種濃度呈正相關(guān)。菌株可在人參不同部位侵染植株并在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在根部和葉部定殖量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢，而在莖部呈先升高后平緩趨勢。研究還發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌NJ13表現(xiàn)出對宿主特定部位具有一定的偏好性，隨著時間推移在莖部的定殖量高于其他部位。田間試驗證明，生防細(xì)菌NJ13對人參黑斑病具有較好的防治作用，其中0.76×108 cfu·mL^-1發(fā)酵液防效達(dá)75.62%，高于對照藥劑0.67 mg·L^-150%嘧菌環(huán)胺WG的防效（73.06%）。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)生細(xì)菌； 定殖； 人參黑斑病； 生物防治

人參Panax ginseng CA Mey為五加科人參屬多年生宿根草本植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，素有“百草之王”的美譽(yù)，主要分布在我國東北長白山地區(qū)。由鏈格孢菌Alternaria panax Whetz.引起的人參黑斑病，是人參生產(chǎn)上發(fā)生最為普遍、分布最為廣泛、為害最為嚴(yán)重的病害之一。該病害主要為害人參地上部，包括葉片、莖稈、花梗和果實等部位，尤以葉斑和莖斑發(fā)生最為普遍，吉林省高發(fā)期集中在7—8月份，常年發(fā)病率在20%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)80～100%，造成早期落葉、植株枯萎、不結(jié)實，參根和參籽減產(chǎn)，品質(zhì)下降^[1]。目前，生產(chǎn)上人參黑斑病主要以化學(xué)防治為主，然而在病害防治過程中化學(xué)農(nóng)藥的不科學(xué)使用，暴露出了人參農(nóng)藥殘留超標(biāo)、出口率降低、病原菌抗藥性產(chǎn)生以及污染生態(tài)環(huán)境等系列問題。因此，生物防治等更為安全有效的防治措施研究亟待開展。

目前國內(nèi)外關(guān)于人參黑斑病生物防治的研究報道相對較少，主要集中在生防菌的分離篩選及發(fā)酵條件研究。崔立萍等^[2]從土壤和人參黑斑病菌組織中分離篩選出對人參黑斑病菌有拮抗作用的菌株22個。李勇等^[3]從人參根中分離出40株內(nèi)生細(xì)菌，通過對峙培養(yǎng)篩選獲得了對人參黑斑病菌有抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌Stenotrophomonas maltophilia和Bacillus sp.。周如軍等^[4-5]從人參根際土壤中篩選到對人參銹腐病菌有拮抗活性的細(xì)菌2株和真菌1株，其對人參黑斑病菌有一定的抑菌效果，并對上述菌株進(jìn)行了鑒定及最適發(fā)酵條件研究。

生防菌在植物體內(nèi)的有效定殖是其控制植物病害的關(guān)鍵，因此，明確生防菌的定殖特性是揭示其生防機(jī)制和評價其應(yīng)用潛力的重要依據(jù)。而目前關(guān)于人參內(nèi)生菌的定殖及人參黑斑病田間生物防治研究還未見報道。本課題組從人參莖部分離獲得了1株對人參主要病害病原菌具有較好抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌菌株NJ13，經(jīng)鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus，明確了最適發(fā)酵培養(yǎng)條件^[6]。為進(jìn)一步挖掘NJ13菌株的生防潛力，本研究擬對菌株在人參體內(nèi)的定殖特性及其對人參黑斑病的田間防治效果進(jìn)行分析，為開展該菌株更為廣泛的生物防治及相關(guān)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 供試生防菌株NJ13 B. methylotrophicus，由本課題組分離獲得；人參黑斑病菌A. panax由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

NJ13按常規(guī)方法在NA（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）上繁殖保存，其發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖3%、可溶性淀粉1.5%，酵母浸粉1.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.5%，起始pH 8.0；靶標(biāo)菌在常規(guī)PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）上繁殖保存。

1.2 試驗藥劑 利福平（rifampicin， Rif）和硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate， Stre），購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司，分別使用甲醇和無菌水溶解。50%嘧菌環(huán)胺WG購于先正達(dá)中國投資有限公司。

2 方法

2.1 NJ13菌株發(fā)酵液的制備 將NJ13菌株劃線接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d。待菌落長好后用直徑1 cm的打孔器打取2塊菌碟，接種于滅菌的LB培養(yǎng)液（胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.4）中培養(yǎng)10 h，制備成發(fā)酵種子液，4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，起始pH 8.0、搖瓶（250 mL）裝量75 mL/瓶，轉(zhuǎn)速為180 r·min^-1，28 ℃搖瓶培養(yǎng)96 h得培養(yǎng)液。

2.2 NJ13對人參黑斑病菌的抑制作用 采用平板對峙法^[7]測定NJ13菌體對人參黑斑病菌的抑制作用，取培養(yǎng)7～10 d的人參黑斑病菌平板，用直徑8 mm的打孔器在菌落邊緣打下菌碟，置于PDA平板一側(cè)，另一側(cè)放入8 mm的細(xì)菌菌碟，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，測定抑菌帶大小。

采用混菌法^[7]測定NJ13代謝物對人參黑斑病菌的抑制作用，①對將1 mL無菌水加入人參黑斑病菌的培養(yǎng)試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養(yǎng)基10 mL 混勻后到入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板。②將NJ13發(fā)酵液12 000 r·min^-1離心30 min，取上清液，然后用0.22 μm的滅菌細(xì)菌過濾器除菌得無菌培養(yǎng)濾液備用。③將無菌牛津杯置于充分冷卻后的平板中央，向牛津杯中加入200 μL無菌發(fā)酵液，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，十字交叉法測定抑菌圈直徑。endprint