龐嘉祺 熊浩賴蘭黃秋紅鄭億慶

年齡相關性聽力損失(age-related hearing loss，AHL)即老年性聾，是僅次于關節(jié)炎和高血壓的世界第三大常見慢性疾病。據(jù)2006年全國第二次殘疾人抽樣調(diào)查推算，全國60歲以上老年人中老年性聾患者高達1 364.49萬[1]。AHL的發(fā)病機制目前尚不明確，其病變部位涉及聽力傳導通路的各個區(qū)域，但尤以內(nèi)耳組織的退行性變最為多見，近年來的文獻已證實細胞凋亡是耳蝸損傷的重要機制[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2, Sir2)相關酶(sirtuin， SIRT)是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotin-amide adenine dinucleotide, NAD+)依賴的去乙?；?，在哺乳動物中有七個同系物(SIRT1～7)，其中，SIRTl蛋白主要分布在細胞核中，與常染色質(zhì)結(jié)合在一起，參與多種基因的表觀遺傳調(diào)節(jié)。SIRT1作用底物不僅局限于組蛋白，還作用在一些非組蛋白底物的去乙?；?P53[3]、FOXO[4]；SIRT1參與DNA損傷修復、細胞代謝、衰老及凋亡的調(diào)控，已被證明與一些年齡相關性疾病，如癌癥、糖尿病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性病變有關[5]；但SIRT1是否在耳蝸內(nèi)表達尚不清楚。C57BL/6小鼠是最常用AHL動物模型，在5～8月齡時其聽力開始出現(xiàn)下降，并隨年齡增長呈漸進性加重，其耳蝸病理表現(xiàn)為毛細胞丟失、神經(jīng)元數(shù)量減少及血管紋萎縮[6，7]。因此，本研究擬通過觀察SIRT1在不同月齡C57BL/6小鼠耳蝸中的表達，探討SIRT1與AHL發(fā)生的關系。

1 資料與方法

1.1實驗動物及分組 健康的C57BL/6近交系小鼠(由中山大學動物管理中心提供)46只，其中 1～2月齡小鼠23只(青年組)，體重12～15 g；12～16月齡小鼠23只(老年組)，體重25～30 g。

1.2實驗方法

1.2.1聽性腦干反應(ABR)檢測 采用Tucker-Davis Technologies(TDT系統(tǒng)III，F(xiàn)L，美國)系統(tǒng)專用電阻檢測儀分別對兩組小鼠行雙耳ABR檢測。小鼠用10%水合氯醛5 μl/g行腹腔注射麻醉，置于聽力檢測隔聲屏蔽室內(nèi)的恒溫毯上，維持小鼠體溫在37 ℃左右，針式記錄電極置于頭頂皮下，參考電極置于受試耳乳突皮下，接地電極置于鼻尖。刺激聲為頻率4、8、16和32 kHz的短純音，掃描時間為10 ms，帶通濾波頻率為300～3 000 Hz；短純音刺激的持續(xù)時間為4 ms，上升和下降時間0.5 ms；反應電位放大10 000倍，平均疊加1 024次；最大刺激聲強度(聲壓級) 90 dB SPL，首先以10 dB遞減刺激聲聲強，接近閾值時以5 dB遞減，以能分辨出ABR波I的最低刺激強度為ABR的反應閾，每只小鼠測3次，取平均值作為閾值。

1.2.2合成互補DNA(complementary DNA, cDNA) 每組隨機抽取20只C57BL/6小鼠，隨機分成4組。于解剖顯微鏡下分離得耳蝸基底膜，用TRIzol Reagent(Invitrogen,美國)法提取組織的總RNA，Nanodrop 2000/2000C(Thermo Scientific，美國)測定純度和濃度；取500 ng總RNA，應用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒(TaKaRa，日本)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.2.3cDNA產(chǎn)物行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增 SIRT1引物序列為5′-CGGCTACCGAGGTCCATATAC-3′(前引物)，5′-ACAATCTGCCACAGCGTCAT-3′(后引物)，產(chǎn)物長度為135 bp；內(nèi)參基因GAPDH引物序列為 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′(前引物)5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′(后引物)，產(chǎn)物長度為120 bp，由Invirtrogen公司合成。用TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye(TaKaRa，日本)于雙巢式梯度PCR儀(BIO-RAD，美國)行PCR擴增，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠行電泳。

1.2.4cDNA產(chǎn)物行實時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR) SIRT1和GAPDH引物序列同上，應用SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa，日本)于LightCycler480 熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)行qRT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參基因，計算兩組小鼠SIRT1 mRNA的相對表達量；重復實驗4次，取平均值。

1.2.5耳蝸切片免疫熒光染色：每組3只小鼠斷頭處死后取出耳蝸，參照文獻[8]處理耳蝸，在SYD-K2040行冰凍切片，片厚10 μm。對切片進行染色[8]，一抗SIRT1抗體(SANTA CRUZ，美國)稀釋至1:200，陰性對照一抗為PBS；二抗 Alexa Fluor 594染料標記的驢抗兔IgG抗體(Life Technologies，美國)稀釋至1:200，在研究級正置熒光顯微鏡BX63(奧林巴斯，日本)下觀察，用Image J軟件分析各區(qū)域免疫熒光陽性面積及平均熒光強度。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)正態(tài)性分布和方差齊性進行檢驗，符合則行兩組獨立樣本t檢驗，不符合則行秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠的ABR反應閾比較 青年組和老年組小鼠ABR反應閾見表1。老年組小鼠4、8、16、32 kHz各頻率ABR反應閾均高于青年組， 差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為-12.929，-18.958，-18.529，-12.338，均為P<0.001)，提示老年組C57BL/6小鼠聽力較青年組明顯下降。

表1 兩組C57BL/6小鼠各頻率ABR反應閾(n=23只)

注：*與青年組比較，P<0.001

2.2兩組小鼠耳蝸中SIRT1 mRNA的表達 青年組和老年組小鼠耳蝸SIRT1 mRNA的PCR擴增結(jié)果見圖1，可見，在青年和老年耳蝸組織中， 在120 bp可得到GAPDH mRNA特異性條帶，亮度基本一致，而在135 bp均可得到SIRT1 mRNA特異性條帶，青年組電泳條帶亮度明顯高于老年組；實時定量qRT-PCR結(jié)果提示，青年組和老年組SIRT1mRNA相對含量分別為1.004±0.102和0.457±0.292(t=3.90，P<0.01)，提示老年組C57BL/6小鼠耳蝸內(nèi)SIRT1 mRNA的表達明顯低于青年組。

圖1 SIRT1 mRNA在耳蝸中的表達Y：青年組；O：老年組；GAPDH：內(nèi)參基因

表2 兩組小鼠Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)、外側(cè)壁的SIRT1蛋白表達陽性面積及平均熒光強度比較

注：*與青年組比較，P<0.001

2.3SIRT1蛋白在兩組小鼠耳蝸中的表達 青年組小鼠耳蝸中SIRT1主要分布在內(nèi)毛細胞、外毛細胞、支持細胞、血管紋細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞的細胞核(圖2)；老年組小鼠耳蝸可見外毛細胞和螺旋神經(jīng)元大量丟失，血管紋萎縮(圖3)；老年組小鼠的Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋SIRT1蛋白表達陽性面積均較青年組縮小(表2，t值分別=44.089、33.168、29.493，均P<0.001)，在殘存的內(nèi)毛細胞、血管紋細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞胞核中，老年組SIRT1蛋白的平均熒光強度較青年組顯著下降(表2，t值分別為66.809、35.652、12.643，均P<0.001)。

3 討論

去乙酰化酶Sir2在代謝、衰老、凋亡等生命活動中起重要調(diào)節(jié)作用，已證實其過表達可延緩酵母、線蟲、果蠅的衰老，延長其壽命[9]。SIRT1是在哺乳動物中Sir2同源性最高的同系物[10]，SIRT1表達模式的改變參與眾多生理病理活動，如：在老年動物腦組織中SIRT1表達明顯降低[11，12]，冠狀動脈內(nèi)皮細胞中SIRT1的表達亦降低[13]，但SIRT1在耳蝸中的表達及與耳蝸病理改變的關系尚未闡明。本研究結(jié)果顯示，老年組C57BL/6小鼠ABR反應閾較青年組明顯提高，表現(xiàn)出年齡相關性的聽力損失特點，與以往文獻報道相符[6，7]；在青年組C57BL/6小鼠耳蝸中SIRT1 mRNA和蛋白大量表達，其中SIRT1蛋白主要在內(nèi)毛細胞、支持細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細胞、血管紋纖維細胞和中間細胞的細胞核表達，在外毛細胞的細胞核也有中等程度表達；在老年組C57BL/6小鼠中，SIRT1 mRNA和蛋白的表達明顯下降，雖然，其外毛細胞大量丟失是SIRT1減少的重要原因之一，但在殘存的內(nèi)毛細胞中，SIRT1蛋白表達量亦明顯下降。可見，SIRT1可能參與耳蝸的年齡相關性病理改變及AHL的發(fā)生。

衰老被認為是活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導的氧化應激損傷在機體累積多年引起的一個不可避免的過程。氧化應激指機體受到多種病理因素刺激后，體內(nèi)ROS產(chǎn)生過多，抗氧化能力下降，打破了機體正常氧化/還原動態(tài)平衡，造成DNA氧化損傷和蛋白質(zhì)的表達異常，干擾正常生命活動，使機體處于易損狀態(tài)。盡管有內(nèi)源性抗氧化劑的存在，在氧化磷酸化反應電子轉(zhuǎn)運時，仍有相當一部分ROS可離開線粒體，造成細胞內(nèi)大分子如膜磷脂、蛋白質(zhì)、DNA的損害或功能下降。此外，線粒體內(nèi)積累的ROS可以通過細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中觸發(fā)細胞凋亡[14]，ROS損傷組織和誘導細胞凋亡與多種老年性相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如糖尿病[9]、癌癥[3]、神經(jīng)退行性病變[14]、動脈粥樣硬化[15]、年齡相關性聽力損失[16，17]等。已證明SIRT1可提高細胞對ROS介導氧化應激的抵抗[18]，具有抗細胞凋亡作用[9]，如：在人結(jié)腸癌細胞中，SIRT1增加p53去乙酰化，使其重新進入細胞周期，減少凋亡[3]；在主動脈和冠狀動脈內(nèi)皮細胞中，過表達SIRT1可抑制其衰老、凋亡，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生[15]；在腎臟球系膜細胞中，SIRT1通過Smad7去乙酰化抑制轉(zhuǎn)化生長因子β誘導凋亡[19]。多項研究表明，隨年齡增加，耳蝸中ROS水平的提高或抗氧化能力的減退可導致大量耳蝸細胞的凋亡，是AHL發(fā)生的重要原因[20]；從本研究結(jié)果看，SIRT1在耳蝸中的表達隨C57BL/6小鼠年齡增長而下調(diào)，提示SIRT1的減少可能誘導耳蝸細胞的凋亡，參與AHL的發(fā)生。

圖2 SIRT1蛋白在青年C57BL/6小鼠耳蝸中的表達 a～c：青年鼠Corti器；IHC為內(nèi)毛細胞，OHC為外毛細胞，DC為Deiter樣細胞，BC為邊界細胞，IS為內(nèi)溝細胞，IPh為內(nèi)指細胞；d～f：青年鼠螺旋神經(jīng)節(jié)；SGC為螺旋神經(jīng)節(jié)細胞；g～i為青年鼠血管紋及螺旋韌帶，F(xiàn)C為纖維細胞，IC為中間細胞。標尺：10 μm。n= 3。圖a左下角示內(nèi)毛細胞放大圖；圖c左下角示陰性對照

圖3 SIRT1蛋白在老年C57BL/6小鼠耳蝸中的表達 a～c：老年鼠Corti器；IHC為內(nèi)毛細胞，OHC為外毛細胞，DC為Deiter樣細胞，BC為邊界細胞，IS為內(nèi)溝細胞，IPh為內(nèi)指細胞；d～f：老年鼠螺旋神經(jīng)節(jié)；SGC為螺旋神經(jīng)節(jié)細胞；g～i為老年鼠血管紋及螺旋韌帶，F(xiàn)C為纖維細胞，IC為中間細胞。標尺：10 μm，n= 3。 *表示缺失的外毛細胞

目前唯一被證實可延緩AHL的方法是熱量限制(calorie restriction, CR)[21]，研究表明CR通過上調(diào)sirtuin家族成員SIRT3表達，激活抗氧化系統(tǒng)，延緩AHL的發(fā)生；而SIRT1在多種轉(zhuǎn)錄激活和翻譯后修飾活動中參與調(diào)控SIRT3信號通路[22，23]。因此，上調(diào)SIRT1是否可以延遲AHL的發(fā)生值得進一步研究。

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