李小清，湯 成，潘永林，黃文祥

（1.重慶市中醫(yī)院 肝病科，重慶 400021；2.重慶市九龍坡區(qū)疾病預(yù)防控制中心 慢病科，重慶 400039；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大學(xué)城醫(yī)院 消化中心，重慶 401331；4.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科，重慶 400016）

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在臨床廣泛應(yīng)用， 導(dǎo)致產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的耐藥菌株不斷增多。 阿莫西林（amoxicillin，AMO）是一種半合成的廣譜青霉素，屬氨基青霉素類；對(duì)流感嗜血桿菌、大埃希菌奇異變形桿菌、沙門菌屬、痢疾志賀菌、腦膜炎奈瑟菌和不產(chǎn)酶淋病奈瑟菌等革蘭陰性菌有很強(qiáng)的抗菌活性，對(duì)鉤端螺旋體、梅毒螺旋體也有較好的作用，但AMO 不能抑制可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的金黃色葡萄球菌和腸桿菌[1]。 將β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑他唑巴坦（tazobactam，TAZ）聯(lián)合應(yīng)用，拮抗β-內(nèi)酰胺酶的水解作用，提高抗菌活性，已受到廣泛重視[2，3]。本研究觀察了不同配比AMO/TAZ 的體內(nèi)外抗菌作用， 為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 藥物

注射用AMO：規(guī)格1.0g/瓶； 批 號(hào)L020601； 含 量96.7%； 注射用TAZ： 規(guī)格0.1g/瓶； 批號(hào)0201001； 含量90.7%。 山東齊魯制藥廠生產(chǎn)。 準(zhǔn)確稱取各種試驗(yàn)所需藥品，加入生理鹽水配制成濃度為2560mg/L 的原液。不同配比的藥物AMO/TAZ（1∶1、2∶1、4∶1、8∶1）由原液配制。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠體重20g±2g，250 只，雌雄各半。 動(dòng)物來源重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心； 級(jí)別： 清潔級(jí)； 許可證號(hào)：SCXK（渝）2012-0001。

1.3 受試細(xì)菌

實(shí)驗(yàn)所用臨床分離菌株包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食假單胞菌、腸桿菌屬、鮑曼不動(dòng)桿菌、沙門氏菌、沙雷氏菌屬、枸櫞酸桿菌、其他克雷伯菌、銅綠假單胞菌、其他假單胞菌、志賀氏菌等14 種421 株， 其中產(chǎn)酶菌231 株， 產(chǎn)酶率為54.87%。 每株細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)瓊脂平板分純，37℃過夜培養(yǎng)，稀釋到0.5 麥?zhǔn)宵c(diǎn)用于實(shí)驗(yàn)。 每次實(shí)驗(yàn)均用大腸埃希菌ATCC25922、 金黃色葡萄球菌ATCC25923 和銅綠假單胞菌ATCC27853 作為藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株。 細(xì)菌在MH培養(yǎng)基、MH 肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18～20h。

1.4 瓊脂二倍稀釋法檢測(cè)MIC[4]

1.4.1 含藥瓊脂制備

將已稀釋的抗菌藥物加入滅菌的MH 瓊脂（45～50℃）中充分混勻， 傾入平皿瓊脂厚度為4mm。 藥物濃度梯度：0.0625，0.125，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，64.0，1 28.0，256.0 mg/L。

1.4.2 細(xì)菌接種

將0.5 麥?zhǔn)媳葷岫染合♂?0 倍， 以多頭接種器吸取約1～2μl 接種于含藥瓊脂表面，每點(diǎn)菌數(shù)約104CFU，稀釋的菌液于15min 內(nèi)接種完畢。

1.4.3 結(jié)果判定

在質(zhì)控菌株實(shí)驗(yàn)結(jié)果正確的基礎(chǔ)上，將平板置于暗色無反光表面判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，以抑制細(xì)菌生長的藥物稀釋濃度為終點(diǎn)濃度。

1.5 感染保護(hù)實(shí)驗(yàn)[5～7]

1.5.1 菌液稀釋方法

將致病性大腸埃希菌于實(shí)驗(yàn)前1d 接種于2ml 營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)6h， 取此菌液0.1ml 轉(zhuǎn)種于10ml 營養(yǎng)肉湯內(nèi)，37℃培養(yǎng)18h，即為實(shí)驗(yàn)用菌原液。 將菌原液適當(dāng)稀釋，用5%高活性干酵母液稀釋至100%最低致死量（MLD）。

1.5.2 （ED50）動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為AMO 組，AMO/TAZ （1∶1，2∶1，4∶1）組和空白對(duì)照組（注射同體積的生理鹽水）；每組6 個(gè)濃度（各藥物用生理鹽水溶解后，稀釋至所需濃度，2 個(gè)相臨劑距為0.25～0.5），每個(gè)濃度10 只，雌雄各半。 實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射菌量1MLD 菌液0.5ml 以感染小鼠，1h 后皮下給予各組藥0.2ml。 記錄感染后24h、48h 和72h 各給藥組及空白對(duì)照組小鼠的死亡數(shù)或存活數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用BLISS 法計(jì)算ED50值和ED50的95%可信限， 應(yīng)用方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 體外抗菌作用

對(duì)421 株試驗(yàn)菌在4 種配比AMO/TAZ 聯(lián)合用藥和單用AMO 的MIC50、MIC90進(jìn)行測(cè)試。 對(duì)不同配比AMO/TAZ和AMO 間的MIC50進(jìn)行比較， 經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)AMO/TAZ（1∶1，2∶1，4∶1）3 種配比與單用AMO 的MIC50差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)合不同配比AMO/TAZ 的MIC50顯著高于AMO菌種數(shù)，以AMO/TAZ 的2∶1、4∶1 配比最佳。 詳見表1。

2.2 感染保護(hù)試驗(yàn)

體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果，AMO 的ED50值為238.32mg/kg，ED95在447.72mg/kg； 而AMO/TAZ （2∶1、4∶1）ED50分別為46.61mg/kg、51.40mg/kg，比AMO（1∶0）低5 倍左右，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AMO/TAZ（2∶1）與AMO/TAZ（4∶1）間ED50差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。

表2 AMO/TAZ （2∶1，4∶1）對(duì)大腸埃希菌感染小鼠的保護(hù)作用

表1 不同比例配比AMO/TAZ 與AMO 的MIC50 比較

3 討論

AMO 在臨床上常用于敏感菌所致的各種感染， 隨著其廣泛使用， 產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的耐藥株不斷增多， 單用AMO 對(duì)產(chǎn)酶菌株感染無效。 將β-內(nèi)酰胺酶抑制劑-TAZ與AMO 聯(lián)合，不僅能克服相應(yīng)耐藥性，還能拓寬抗菌譜，增強(qiáng)抗菌活性。 我們以國產(chǎn)AMO/TAZ 及其單組分進(jìn)行的體內(nèi)和體外抗菌活性研究結(jié)果顯示： 聯(lián)合用藥比單用AMO 的抗菌活性高，抗菌譜也擴(kuò)大，但幾個(gè)比配之間有一定差別，無論從MIC 及體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)，AMO/TAZ（2∶1）的抗菌效果均要略強(qiáng)于AMO/TAZ （4∶1）， AMO/TAZ 2∶1 為最佳抗菌配比，與文獻(xiàn)研究一致[8]。

綜上所述，AMO 聯(lián)合TAZ 后，抗菌活性明顯增強(qiáng)。 對(duì)所有產(chǎn)酶的革蘭氏陽性球菌有較強(qiáng)的抗菌作用；對(duì)產(chǎn)酶的革蘭氏陰性菌（特別是產(chǎn)ESBLS的菌株）除嗜麥芽胞桿菌及銅綠假單胞菌外也有較強(qiáng)的抗菌作用。 總之，酶抑制劑TAZ 的加入，擴(kuò)大了AMO 的抗菌譜，增強(qiáng)了抗菌作用，提示臨床療效可能更好，具有進(jìn)一步開發(fā)研究的價(jià)值。

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