梅建鳳,李 莎,茅鶴婷,王 鴻,應(yīng)國(guó)清

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310032)

瓊膠(agar)是一種從紫菜、石花菜和江蘺等海洋紅藻中提取的多糖。瓊膠由瓊脂糖和硫瓊膠組成,其中瓊脂糖是由(l→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3,6內(nèi)醚-α-L-半乳糖交替組成的瓊二糖重復(fù)單位連接而成的線形鏈狀分子。瓊膠因其具有優(yōu)良的膠凝性、穩(wěn)定性、黏滯性和滲透性,因此在食品、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[1]。瓊膠寡糖(agaro-oligosaccharide)就是瓊膠經(jīng)降解后聚合度為 2～10的低聚糖。近年來的研究表明瓊膠寡糖有多種生理活性,如抗氧化、降血脂,免疫增強(qiáng),抗過敏和抑制糖苷酶等活性,是一種極具開發(fā)潛力的功能低聚糖[2]。

由瓊膠制備瓊膠寡糖可以采用化學(xué)降解和酶降解 2種方法,相比于化學(xué)降解法,酶降解法具有寡糖得率高、生物活性高和工藝環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。瓊膠酶就是能夠?qū)偰z水解為寡糖或單糖的酶類,它不僅可用于瓊膠寡糖的制備,還可以應(yīng)用于分子生物學(xué)研究中回收瓊脂糖凝膠中的DNA和RNA;或作為工具酶用于海藻的單細(xì)胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等[3-4]。目前,Sigma-Aldrich有限公司已有瓊膠酶銷售,其來自大西洋假單胞菌(Pseudomonas atlantica),價(jià)格昂貴,如純度大于5 000 U/mg的產(chǎn)品,1 kU包裝的價(jià)格為1854.45 元人民幣[5]。因此,尋找一種產(chǎn)酶活性高、性狀穩(wěn)定、易于培養(yǎng)的瓊膠酶產(chǎn)生菌仍是瓊膠酶研究與應(yīng)用的關(guān)鍵。本文從東海浙江海域采集了海水樣品,進(jìn)行瓊膠酶產(chǎn)生菌的分離和篩選,并對(duì)得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和 16S rDNA序列分子鑒定,確定該菌株的分類地位,旨在獲得產(chǎn)酶活性高的菌株,為瓊膠酶的研究和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 海水樣品

2份海水樣品分別采自東海浙江省舟山市普陀區(qū)附近海域(采集點(diǎn)北緯 29.872811°N,122.404974°E)和東海浙江省臨海市附近海域(采集點(diǎn)北緯28.779320°N,121.670580 °E)。

1.2 培養(yǎng)基

平板和斜面培養(yǎng)基 A(g/L): NaCl 25,NH4Cl 1,MgSO4·7H2O 5,KCl 1,FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.6,瓊脂 20,pH 7.0[6]。

斜面培養(yǎng)基B(g/L): 葡萄糖1,NaCl 20,酵母浸出粉 5,MgSO4·7H2O 5,KCl 1,FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.8,瓊脂 20,pH 7.5[6]。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L): NaNO34,NaCl 10,MgSO4·7H2O 5,KCl 1;FeSO4·7H2O 0.02,CaCl20.2,NaH2PO4·2H2O 0.6,MnCl2·4H2O 0.15,瓊脂 2.5,pH 7.0[6]。

以上培養(yǎng)基均采用121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌;產(chǎn)酶培養(yǎng)基裝250 mL玻璃三角燒瓶,每瓶裝40 mL,8層紗布扎口。

所有實(shí)驗(yàn)試劑為均為市售分析純或生物試劑。

1.3 方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

海水樣品50 mL于250 mL三角瓶中,加入0.15 g瓊脂粉,30℃搖床培養(yǎng)7 d以上。

1.3.2 平板菌落篩選

將經(jīng)過富集后的海水樣品用無菌人工海水適當(dāng)倍數(shù)稀釋,取0.1 mL涂布平板,28 ℃培養(yǎng)至平板上長(zhǎng)出菌落。觀察菌落形態(tài),挑取能形成明顯凹陷的菌落劃線接種于另一平板,28 ℃培養(yǎng),將形成較深凹陷的單菌落挑至斜面培養(yǎng)基A上培養(yǎng)。

1.3.3 搖瓶培養(yǎng)篩選

挑取斜面菌株的菌苔 2～3環(huán),接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液10 mL,4℃、8000 r/min離心15 min,取上清液測(cè)酶活力。初篩不做重復(fù),淘汰酶活相對(duì)較低的菌株,同法對(duì)剩余菌株進(jìn)行復(fù)篩,每個(gè)菌株做 3個(gè)重復(fù)的搖瓶培養(yǎng),篩選出酶活最高的菌株。

1.3.4 酶活測(cè)定

酶活測(cè)定采用 DNS法[7]: 取磷酸緩沖液(0.2 mol/L,pH7.0)配制的2.5 g/L瓊膠底物溶液9 mL,加入1 mL待測(cè)酶液,45℃、100 r/min水浴搖床中酶解20 min,立即取1 mL酶解液于刻度試管中,加入1 mL DNS溶液、1mL水,沸水浴5min后立即冷卻至室溫,定容至10 mL。于紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定A540,再由 D-半乳糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶解液中的還原糖質(zhì)量濃度。瓊膠酶的活力定義: 在上述反應(yīng)條件下,1mL酶液1min產(chǎn)生l μg還原糖作為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.3.5 16S rDNA序列分析

用EzupTM柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組總DNA,作為PCR模板DNA。擴(kuò)增引物選用細(xì)菌鑒定通用引物: 正向引物27F: 5'-AGAGT TTGATCCTGGCTCAG-3'(對(duì)應(yīng)于E.coli 16S rRNA基因的第8～27個(gè)堿基位置),反向引物1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'(對(duì)應(yīng)于E.coli 16S rRNA 基因的第1492～1510個(gè)堿基位置)[8]。PCR反應(yīng)體系(50μL): 2×PCR Master溶液25 μL(2×PCR Master包括3 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTP、0.1U/μL Tag DNA polymerase 和2×PCR buffer)。DNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,ddH2O 22 μL。擴(kuò)增程序: 94℃預(yù)變性3 min,94℃變性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。取5 μL擴(kuò)增樣品,1%瓊脂糖凝膠,80v電壓電泳檢測(cè)[9]。

引物合成及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司完成。

將測(cè)得的16S rDNA基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上通過BLAST比對(duì),分析其與其他菌株的同源性。并選擇相似度≥98%的菌株的16S rDNA基因序列,采用Mega5.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果和討論

2.1 平板篩選

在本文采集海水的海域,并非海藻生長(zhǎng)區(qū)域,但海水樣品經(jīng)過富集后,采用平板法分離,培養(yǎng)基上有大量瓊膠酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)。雖然菌落較小,多數(shù)菌落周圍會(huì)出現(xiàn)較深的釜底形凹陷,在菌落密集的地方,平板培養(yǎng)基液化深至皿底(圖 1),反映了這些菌株產(chǎn)酶活性較高。選取凹陷較深的菌落,轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基A上培養(yǎng),獲得出了26株具有降解瓊膠能力的菌株。

圖1 平板分離瓊膠酶產(chǎn)生菌的菌落照片F(xiàn)ig.1 Colonies of bacterial strains producing agarase in plate cultivation

2.2 初篩和復(fù)篩

平板篩選出的26株菌株轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)后,新鮮斜面菌體接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基,搖瓶振蕩培養(yǎng)48 h后,測(cè)定發(fā)酵液酶活,篩選出8株酶活相對(duì)較高的菌株。然后將這8個(gè)菌株再經(jīng)斜面活化培養(yǎng)后,新鮮斜面菌種接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基,每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù),搖瓶振蕩培養(yǎng)48 h后,測(cè)定各菌株的瓊膠酶活力,計(jì)算平均值,結(jié)果見表1。

從搖瓶復(fù)篩的結(jié)果可以看出: 這些菌株的產(chǎn)瓊膠酶活力菌均較高,其中菌株G-5的瓊膠酶活力最高,達(dá)到413.8 U/mL。

表1 產(chǎn)瓊膠酶菌株的搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩產(chǎn)酶活力Tab.1 The agarase activity of some strains in the second screening by shaking cultivation

2.3 G-5菌株的菌落和菌體形態(tài)特征

對(duì)產(chǎn)酶活力相對(duì)較高的W-10、G-5和G-6進(jìn)行了分類鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3個(gè)菌株的菌落特征、菌體形態(tài)以及16S rDNA序列均相同,說明它們是同一個(gè)種,所以本文以下僅報(bào)道G-5菌株的鑒定結(jié)果。

G-5菌株在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,菌落半透明,直徑約為3～5 mm,在平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)可以形成很深凹陷,甚至可使培養(yǎng)基開裂。在斜面培養(yǎng)基A上培養(yǎng)7 d,沿劃線呈溝壑狀,但菌體量較少(圖2)。在斜面培養(yǎng)基B上培養(yǎng),因含有葡萄糖和酵母浸出粉,一般24 h即可長(zhǎng)滿斜面,菌落周圍無凹陷。對(duì)該菌種的保藏和分子生物學(xué)鑒定時(shí),便采用斜面培養(yǎng)基B,可以縮短培養(yǎng)時(shí)間,獲得更多的菌體。

圖2 菌株G-5斜面培養(yǎng)菌落形態(tài)Fig.2 Colonies of G-5 on the slant culture

G-5菌株的菌體革蘭氏染色呈陰性,菌體簡(jiǎn)單染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察,菌體呈短桿狀,略有弧形,菌體大小0.58～0.69 μm×1.50～2.26 μm,菌體的光學(xué)顯微鏡照片見圖3。

2.4 16S rDNA序列分析

提取G-5菌株的總DNA,利用細(xì)菌16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖表明,分子量在1500 bp左右,測(cè)序后得可用序列1458 bp。將測(cè)序所得基因序列在NCBI上通過BLAST比對(duì),相似度在98%以及以上的菌株見表2,菌株G-5與這些弧菌的同源性關(guān)系見系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。

圖3 菌株G-5在光學(xué)顯微鏡下菌體照片F(xiàn)ig.3 Cell shape of G-5 observed under optical microscope

菌株G-5的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中15株弧菌(Vibrio sp.)的16S rDNA序列相似度達(dá)到98%及以上,因此可以判斷其是一株弧菌,但與這些菌株的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn),尚不能依據(jù)16S rDNA序列比對(duì)將G-5鑒定到種。目前,已經(jīng)分離到多株能夠產(chǎn)瓊膠酶的弧菌,如Aoki 等[10]分離到的Vibrio sp.AP-2;Sugano等[11]分離到的Vibrio sp.strain JT0107;Araki等[12]分離到的Vibrio sp.PO-303菌株;杜宗軍等[13]分離到Vibrio tubiashii,因未能獲得這些菌株的16S rDNA序列,無法將G-5與它們進(jìn)行親緣關(guān)系比較。NCBI數(shù)據(jù)庫中有一株Vibrio tubiashii(登記號(hào)NR 026129.1),但從系統(tǒng)發(fā)育樹來看,G-5與其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

瓊膠酶具有廣闊的應(yīng)用前景,自1957年Yaphe[14]第一次從海水中分離到能分解瓊膠的細(xì)菌——大西洋假單胞菌(Pseudomonas atlantica),此后人們已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到了多株瓊膠酶產(chǎn)生菌,雖然近年來從陸生環(huán)境分離到了一些降解瓊膠的微生物,但海洋是瓊膠酶產(chǎn)生菌生存的大環(huán)境,從海水中容易分離到瓊膠酶產(chǎn)酶活性較高的菌株。本文通過平板菌落預(yù)篩和搖瓶初篩與復(fù)篩,從浙江省舟山市普陀區(qū)近海海水中篩選到一株瓊膠酶高產(chǎn)菌株G-5,在平板和斜面培養(yǎng)時(shí)即可看出其產(chǎn)酶能力不同凡響,原始菌株液體培養(yǎng)的產(chǎn)酶活力可以達(dá)到413.8U/mL,如進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行誘變育種,優(yōu)化其產(chǎn)酶培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,其產(chǎn)酶活力定能進(jìn)一步提高,具有較高的工業(yè)化應(yīng)用潛力。

表2 NCBI數(shù)據(jù)庫中與G-5菌株BLAST相似度≥98%的菌株Tab.2 The Vibrio strains with similarity of ≥98% by BLAST in the database of NCBI

圖4 依據(jù)16S rDNA序列同源性比較構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the Vibrio sp.strains based on 16S rRNA gene sequence

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