黃 卉 曲育瑩 王秋玲 岳貴娟 李 娜 李建生

·基礎(chǔ)研究·

金龍膠囊抗腦腫瘤的系統(tǒng)生物學(xué)研究

黃 卉①②曲育瑩①②王秋玲①②岳貴娟①②李 娜①②李建生①②

目的：利用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)分析中藥復(fù)方金龍膠囊抗腦腫瘤的分子機(jī)制。方法：取金龍膠囊組及空白對(duì)照組小鼠的原位腦腫瘤組織樣本進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，通過(guò)比對(duì)獲取差異基因；使用一步過(guò)連通測(cè)算和多步驟隱藏節(jié)點(diǎn)測(cè)算獲得拓?fù)浠?；采用富集分析法分析其生物功能；借助MetaCore平臺(tái)構(gòu)建分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：與對(duì)照組相比，金龍膠囊組共有37個(gè)差異基因（倍數(shù)＞2），106個(gè)拓?fù)浠颉＝瘕埬z囊的靶點(diǎn)主要集中在細(xì)胞粘附和凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)組織發(fā)育等。結(jié)論：金龍膠囊通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞特有基因表達(dá)和抑制干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗腦腫瘤作用。

金龍膠囊 基因芯片 系統(tǒng)生物學(xué) 腦腫瘤 機(jī)制

中藥成分復(fù)雜，作用整體性強(qiáng)，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多通路的特點(diǎn)，其藥效發(fā)生機(jī)制一直是研究者長(zhǎng)期從事的熱點(diǎn)課題之一。

金龍膠囊是由守宮、金錢白花蛇和蘄蛇組成用于血瘀郁結(jié)型腫瘤的治療，也可用于晚期癌癥的姑息治療。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金龍膠囊具有較好的抑制原位腦腫瘤動(dòng)物模型中顱內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的作用［1］，但其藥理機(jī)制尚不清楚。本研究選取金龍膠囊干預(yù)后顱內(nèi)腫瘤組織，實(shí)驗(yàn)組為金龍膠囊給藥組，對(duì)照組為給予溶媒的空白組，進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，采用系統(tǒng)生物學(xué)方法［2］對(duì)基因組學(xué)結(jié)果進(jìn)行分析，最終獲取金龍膠囊抗腦腫瘤的分子作用機(jī)制，為中藥藥理機(jī)制研究方法提供新的途徑和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

金龍膠囊（北京建生藥業(yè)有限公司）批號(hào)為100945；5～6周齡雌性裸鼠，合格證號(hào)：SCXK京2009-0004（北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司）；Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片（美國(guó)Affymetrix公司）；MetaCore系統(tǒng)生物學(xué)分析平臺(tái)（湯森路透科技集團(tuán)）。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用外科原位移植方法［3］，建立裸鼠原位腦腫瘤動(dòng)物模型。將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（給予溶媒）和金龍膠囊組，連續(xù)灌胃給藥28 d后處死動(dòng)物，取顱內(nèi)腫瘤組織，提取總RNA，使用RT-PCR方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的cRNA，并進(jìn)行cRNA的純化。cRNA經(jīng)片段化處理后，與Human Genome U133 Plus 2.0基因芯片雜交。雜交16 h后取出芯片，在Affymetrix公司的專用設(shè)備Affymetrix Fluidids Station 450中完成清洗和染色。使用Affymetrix公司的GeneChip Scanner 3000掃描儀對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行掃描，獲取基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。掃描圖像采用Affymetrix GenChip Command Console Software（AGCC）軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，取得金龍膠囊藥物干預(yù)后的差異基因表達(dá)譜。

1.2.2 數(shù)據(jù)前處理 運(yùn)用多陳列對(duì)數(shù)健壯算法（RMA）對(duì)上述取得的基因表達(dá)原始數(shù)據(jù)信息進(jìn)行歸一化處理［4］，并采用最新版本的探針注釋系統(tǒng)，使每1個(gè)探針都能對(duì)應(yīng)1個(gè)獨(dú)立的基因。通過(guò)這些前處理，將會(huì)獲得1個(gè)非冗基因標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)表達(dá)的數(shù)據(jù)集，此數(shù)據(jù)集中分別包含了2個(gè)樣本的基因表達(dá)信息。將金龍膠囊藥物干預(yù)組樣品基因表達(dá)信息與空白對(duì)照組樣品基因表達(dá)信息進(jìn)行比對(duì)，取得差異基因表達(dá)譜，同時(shí)計(jì)算每個(gè)差異表達(dá)基因的差異倍數(shù)。

1.2.3 拓?fù)浠虻墨@取 為了將在分析差異基因的過(guò)程中被忽視但實(shí)際上有可能是藥物發(fā)揮調(diào)控作用的靶點(diǎn)基因挖掘出來(lái)，采用了2種網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湓u(píng)分算法（一步過(guò)連通測(cè)算和多步驟的隱藏節(jié)點(diǎn)測(cè)算），從而挖掘?qū)Σ町惢蛑苯影l(fā)揮調(diào)控作用的因子和間接發(fā)揮調(diào)控作用的重要遠(yuǎn)端因子，“拓?fù)渲匾颉保╰opologically significant genes）。1）一步過(guò)連通測(cè)算［5-6］，采用以下公式：

其中N為GeneGo數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneGo Global NetworkTM）中的蛋白總數(shù)；R為輸入文件中的基因總數(shù)；n為與輸入文件中某特定基因連通的連通總數(shù)；r為與輸入文件中某特定基因有一步連通性的化合物的總數(shù)。對(duì)差異基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中的各化合物連通水平的高低進(jìn)行分析，并評(píng)價(jià)其統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平，旨在尋找與差異基因有一步連通性的重要調(diào)控因子。2）多步驟隱藏節(jié)點(diǎn)分析：采用了拓?fù)湓u(píng)分測(cè)算方法［7-8］，將差異基因整合入一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，來(lái)構(gòu)建這些基因之間通過(guò)最短路徑互相連通的網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)計(jì)算出在這個(gè)最短路徑網(wǎng)絡(luò)圖中穿過(guò)某基因的路徑數(shù)量以及在GeneGo Global NetworkTM數(shù)據(jù)庫(kù)中穿過(guò)此基因的路徑數(shù)量。根據(jù)這些路徑數(shù)目以及與之相對(duì)應(yīng)的原始數(shù)據(jù)，評(píng)估某基因通過(guò)多步驟與輸入文件中特定基因相連通的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性高的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是拓?fù)渲匾?jié)點(diǎn)。

1.2.4 通路及生物學(xué)功能分析 采用富集分析的方法來(lái)探討差異基因和拓?fù)浠虻母黜?xiàng)生物功能。其中GeneGo數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能分析項(xiàng)目為：1）范式通路；2）生物學(xué)過(guò)程網(wǎng)絡(luò)；3）疾病表面標(biāo)志物；4）毒理網(wǎng)絡(luò)；公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能分析為：1）生物學(xué)過(guò)程；2）分子功能；3）細(xì)胞定位，每個(gè)項(xiàng)目的富集程度用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中N為檢測(cè)所用的基因芯片上的基因總數(shù)；R為差異基因和拓?fù)浠蚩倲?shù)；n為某方面中具體某一個(gè)條目中所包含的基因總數(shù)；r為某方面中具體某一個(gè)條目中所包含的差異基因和拓?fù)浠蚩倲?shù)。

1.2.5 機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 以細(xì)胞或組織的特定響應(yīng)為依據(jù)，將以上對(duì)差異基因、拓?fù)浠颉⑼泛蜕飳W(xué)功能的分析內(nèi)容進(jìn)行整合，借助使用MetaCore平臺(tái)上的人工注釋系統(tǒng)（蛋白、蛋白間相互作用關(guān)系、通路）、運(yùn)算工具包和濾器構(gòu)建一個(gè)涵蓋疾病、毒理、藥物響應(yīng)、分子過(guò)程等信息的可視化模型，即藥物機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖。機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建主要涉及以下2個(gè)方面：1）對(duì)多個(gè)信號(hào)通路綜合進(jìn)行構(gòu)建，來(lái)揭示組織或細(xì)胞對(duì)藥物的特定響應(yīng)是如何產(chǎn)生的；2）將與產(chǎn)生這種特定響應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵條目整合入通路中，來(lái)構(gòu)建一個(gè)系統(tǒng)的機(jī)制模型圖。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

利用GeneGo數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)芯片檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得金龍膠囊作用后的差異基因表達(dá)譜。結(jié)果顯示，0.75 g/kg金龍膠囊組與模型組相比，差異倍數(shù)上調(diào)2倍以上的差異表達(dá)基因前10個(gè)（表1），差異倍數(shù)下調(diào)2倍以上的差異表達(dá)基因前15個(gè)（表2）。

2.2 拓?fù)浠?/p>

2.2.1 一步過(guò)連通拓?fù)浠?通過(guò)一步過(guò)連通測(cè)算，共獲得9個(gè)一步過(guò)連通拓?fù)浠颍ū?），其中基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員（MMP-2、Stromelysin-2、MMP-25、Stromelysin-1）對(duì)生理、病理過(guò)程以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的細(xì)胞外基質(zhì)降解即發(fā)揮重要作用［9］，另外還包括與腫瘤相關(guān)的基因GlyT1、Sno-N、TXNDC5、AP-1以及Plasmin。

2.2.2 多步驟拓?fù)浠?拓?fù)湓u(píng)分測(cè)算分析得到作為細(xì)胞粘附分子家族的成員之一整合素（alpha-2/beta-1 integrin、ITGA2、ITGB1）扮演著介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互粘附的角色，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵調(diào)控作用［10］；得到了對(duì)神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)和功能有重要影響并與肺癌細(xì)胞的增殖活動(dòng)相關(guān)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）［11］；以及正黏蛋白MUC1和與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因Stromelysin1等97個(gè)多步驟拓?fù)浠颉?/p>

2.3 通路及生物學(xué)功能分析

將差異基因在7個(gè)項(xiàng)目中分別進(jìn)行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05）；將拓?fù)浠蛟?個(gè)項(xiàng)目中分別進(jìn)行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05）；選取上述結(jié)果中對(duì)差異基因和拓?fù)浠蝻@著性都高的條目（P＜0.05）；將差異基因和拓?fù)浠蛘显谝黄饘?duì)7個(gè)項(xiàng)目的每項(xiàng)分別進(jìn)行富集分析，選取顯著性高的條目（P＜0.05），最終得到6條范式通路和4個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)（表3）。

2.4 機(jī)制網(wǎng)路圖的構(gòu)建

金龍膠囊組與對(duì)照組比對(duì)分析構(gòu)建機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），對(duì)這一網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行簡(jiǎn)化處理（圖2）可見，金龍膠囊能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞特有基因的表達(dá)，抑制干擾素信號(hào)傳導(dǎo)。IFI17（IFIM1）、IFITM2、SERPINA3（ACT）與免疫和炎癥應(yīng)答相關(guān)，而免疫應(yīng)答在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，其中IFI17可通過(guò)抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的激活以及將細(xì)胞周期阻滯在G1期而在IFN-γ抗細(xì)胞增殖過(guò)程中起到關(guān)鍵作用［12］。

表1 差異2倍以上的上調(diào)基因列表Table 1 Genes upregulated for more than twofold

表2 差異2倍以上的下調(diào)基因列表Table 2 Genes downregulated for more than twofold

表3 關(guān)鍵范式通路圖（6個(gè)）和關(guān)鍵生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)（4個(gè)）列表Table 3 Key pathways and process networks

?1.Differential gene；2、3.Hidden nodes圖1 金龍膠囊組與對(duì)照組比對(duì)后構(gòu)建的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Comparison of the network diagram mechanism of the Jinlong capsule group and the control group

?1.Differential gene；2、3.hidden nodes圖2 金龍膠囊的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)化圖Figure 2 A simplified diagram of mechanism of Jinlong capsule

3 討論

系統(tǒng)生物學(xué)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛，為多環(huán)節(jié)藥物作用機(jī)制的研究提供了有力手段。目前抗腫瘤藥物的研究已從傳統(tǒng)的細(xì)胞毒性向多環(huán)節(jié)作用機(jī)制的新型藥物方向發(fā)展。中藥的作用機(jī)制較為復(fù)雜，因此如何利用新型技術(shù)發(fā)掘抗腫瘤藥物的分子作用機(jī)制成為焦點(diǎn)。應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)分析復(fù)方中藥金龍膠囊作用前后mRNA表達(dá)水平的改變，從分子水平了解中藥的多作用靶點(diǎn)、方式及代謝途徑，并進(jìn)一步了解其作用機(jī)制。

機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建是整個(gè)機(jī)制分析中非常重要的一環(huán)。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，構(gòu)建機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖的方法差別較大［13］，但大體上均是以細(xì)胞或組織的特定響應(yīng)為依據(jù)，將之前的分析內(nèi)容進(jìn)行整合，構(gòu)建一個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖［14-15］。本研究借助MetaCore平臺(tái)上的人工注釋系統(tǒng)（蛋白、蛋白間相互作用關(guān)系、通路），同時(shí)也基于真核生物的信號(hào)通路來(lái)完成。為了探究核心的信號(hào)通路，本研究也納入了一部分不在關(guān)鍵通路里但是功能明確的效應(yīng)基因群，使核心通路發(fā)揮功能效應(yīng)的來(lái)龍去脈更加明晰，也使得整個(gè)功能模型更加完整。因此，整個(gè)構(gòu)建機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖的分析過(guò)程是以關(guān)鍵通路圖為基礎(chǔ)，作為搭建的主要框架。由于GeneGo范式通路圖是以實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為基礎(chǔ)而搭建的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)，因此為機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建提供了更高的可信度。

本研究肯定了金龍膠囊對(duì)小鼠腦腫瘤的治療作用，通過(guò)使用基因組學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)分析方法，獲得了金龍膠囊干預(yù)后腦腫瘤組織的差異基因表達(dá)譜，并通過(guò)分析測(cè)算得到了與之相關(guān)聯(lián)的發(fā)揮調(diào)控作用的隱藏節(jié)點(diǎn)（即拓?fù)浠颍?，通過(guò)對(duì)其生物功能的分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的生物功能主要集中在細(xì)胞黏附和凋亡、免疫應(yīng)答、神經(jīng)組織的發(fā)育等方面?；趯?duì)差異基因、拓?fù)浠蛞约捌渖锕δ艿母患治?，本研究?gòu)建出金龍膠囊發(fā)揮抗腦腫瘤作用的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖，將金龍膠囊的作用靶點(diǎn)、通路以及這些靶點(diǎn)通路之間的關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式展現(xiàn)出來(lái)，充分體現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究理念，也顯示出系統(tǒng)生物學(xué)分析方法的可行性和優(yōu)勢(shì)。該網(wǎng)絡(luò)圖顯示，金龍膠囊可以刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及相關(guān)信號(hào)，促進(jìn)神經(jīng)元的分化，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞骨架的重構(gòu)。這種行為提示，受金龍膠囊抗腦腫瘤作用的影響，一部分腦腫瘤細(xì)胞可能會(huì)分化為神經(jīng)細(xì)胞。金龍膠囊的另一個(gè)重要作用機(jī)制是下調(diào)干擾素相關(guān)信號(hào)，這些與免疫應(yīng)答和抗炎反應(yīng)關(guān)系密切。由于炎癥在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，金龍膠囊對(duì)干擾素相關(guān)信號(hào)的下調(diào)作用應(yīng)當(dāng)是其發(fā)揮抗腫瘤作用的重要方面。當(dāng)然，這種預(yù)測(cè)性的分析結(jié)果還需要一系列實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證，但其對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和開展具有極其重要的指導(dǎo)意義，為機(jī)理的深入闡釋奠定了基礎(chǔ)。

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（2014-02-20收稿）

（2014-04-24修回）

（本文編輯：楊紅欣）

Study of anti-cancer traditional Chinese medicine using systems biology technology

Hui HUANG1,2,Yuying QU1,2,Qiuling WANG1,2,Guijuan YUE1,2,Na LI1,2,Jiansheng LI1,2
Correspondence to:Jiansheng LI;E-mail:lyz988@gmail.com

1Beijing Vital Medicine Research&Development Centre,Beijing 100039;2Beijing Jiansheng Pharmaceutical Co.Ltd,Beijing

100039,China.

Objective:This article focuses on the research of molecular mechanism of brain tumor treatment using the Jinlong capsule via system biology technology.Methods:Human Genome U133 Plus 2.0 gene chip was used to detect the genes of samples,including the brain tumor tissues of nude mice after Jinlong capsule intervention and those of blank control group mice.Differentially expressed genes were identified based on fold change between the two groups.To identify the upstream regulators of the response signatures,the differentially expressed genes were subjected to interactome analysis by one-step overconnectivity test and multi-step hidden node algorithm.A set of genes preferentially connected to differentially expressed genes via direct interactions and pathways(called topologically significant genes)was generated.Concurrent pathway enrichment analysis on key pathways,processes,and functional units of both differentially expressed genes and topologically significant genes was performed to identify the most likely signaling pathways connecting regulators and effector genes.Finally,condition-specific networks(called causal network)were built to model molecular events by using a set of manually annotated protein interactions,pathways,and proteins and a toolkit of algorithms and filters on Meta-Core platform.Results:A total of 37 differentially expressed genes have been identified between Jinlong capsule-treated sample and vehicle sample with fold change of 2.Connection analysis identified 106 topologically significant genes.The main feature of the causal network is stimulation of neural cell specific genes that regulate normal cell physiology,particularly developmental processes and apoptosis.Another important effect of the Jinlong capsule is its inhibition of the gene markers of interferon response,suggesting signaling inhibition,followed by de-activation of immune response.Conclusion:Jinlong capsule exerts an anti-neoplastic effect by inducing stimulation of neural cell and by inhibiting interferon signal transduction.

Jinlong capsules,gene chip,systems biology,brain tumor,mechanism

10.3969/j.issn.1000-8179.20140305

黃卉 博士，副研究員。研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)，包括重組蛋白表達(dá)、未知基因功能預(yù)測(cè)等。

①北京鮮動(dòng)物藥研制中心（北京市100039）；②北京建生藥業(yè)有限公司

李建生 qiuling0915@163.com

E-mail：huanghui_phd@yeah.net