張永清+吳清平

摘要：采用懸液定量殺菌和流動(dòng)殺菌的方法，對(duì)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞鏈球菌（Streptococcus faecium） 和大腸桿菌（Escherichia coli）的臭氧消毒效果進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，懸液定量殺菌試驗(yàn)中，臭氧濃度0.36 mg/L，作用10 min后，銅綠假單胞菌存活率小于1.0 %；臭氧濃度0.31 mg/L，作用3 min后，糞鏈球菌存活率小于0.1%；臭氧濃度在0.45 mg/L及以上，作用10 min后，大腸桿菌存活率在2.0%以下。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)中，臭氧濃度0.20～0.60 mg/L，作用3 min后，大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率在99.99%以上。

關(guān)鍵詞：臭氧；消毒；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）；糞鏈球菌（Streptococcus faecium）；大腸桿菌（Escherichia coli）

中圖分類號(hào)：TS201.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1543-03

Killing Effects of Ozone on Pathogens in Mineral Water

ZHANG Yong-qing1，2，3，4，WU Qing-ping1，ZHANG Ju-mei1，GUO Wei-peng1，PENG Fei-ting1，YANG Xiu-hua1

（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，

State Key Laboratory of Applied Microbiology （Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base）， South China， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China； 2. Wuhan Institute of Virology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430071， China；

3. Graduate University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；

4. College of Food Science and Engineering， Xuchang University， Xuchang 461000，Henan， China）

Abstract： Both suspension quantitative germicidal test and flow germicidal test were used to study disinfection effects of ozone on the Pseudomonas aeruginosa， Streptococcus faecium and Escherichia coli. The suspension quantitative germicidal test found that the survival rate of Pseudomonas aeruginosa treated with 0.36 mg/L of ozone for 10 min was less than 1.0%， and that of Streptococcus faecium reacted with 0.31 mg/L of ozone for 10 min was less than 0.1%. When the ozone was more than 0.45 mg/L and the time was 10 min， the survival rates of Escherichia coli was under 2.0%. The results of the flow germicidal test showed that the probability of survivability of Escherichia coli， Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus faecium treated with 0.20-0.60 mg/L of ozone for 3 min were under 0.01%， with the killing rates of more than 99.99%.

Key words： ozone； disinfection； Pseudomonas aeruginosa； Streptococcus faecium； Escherichia coli

臭氧消毒可迅速殺滅使人和動(dòng)物致病的各種病菌、病毒等微生物。世界衛(wèi)生組織對(duì)其滅菌功效曾歸納比較，臭氧與其他殺菌劑對(duì)大腸桿菌的殺滅效果依次為：臭氧（O3）>次氯酸（HClO）>二氧化氯（ClO2）>銀離子（Ag+）>次氯酸根（ClO-）>高鐵離子（Fe3+）>三氯胺（NCl3）。因此，臭氧消毒作為氯消毒的替代方法，在水廠中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。各廠家為了使微生物指標(biāo)達(dá)標(biāo)不斷加大臭氧投放量，但當(dāng)原水中有溴離子時(shí)，臭氧消毒可以產(chǎn)生消毒副產(chǎn)物溴酸鹽。溴酸鹽是一種2B級(jí)潛在致癌物，具有一定DNA和染色體水平的遺傳毒性[1]。因此，利用臭氧消毒時(shí)，在微生物達(dá)標(biāo)的情況下還需考慮臭氧消毒副產(chǎn)物溴酸鹽的問(wèn)題。

《飲用天然礦泉水》（GB8537-2008）國(guó)標(biāo)規(guī)定，除臭氧外，礦泉水在水處理中不允許添任何物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)消毒和處理，且消毒副產(chǎn)物溴酸鹽的限量為10 μg/L。因此，隨著中國(guó)瓶（桶）裝飲用水尤其是礦泉水的迅猛發(fā)展，原水含有溴化物的企業(yè)必須解決礦泉水中致病菌污染和臭氧消毒副產(chǎn)物溴酸鹽問(wèn)題。調(diào)查結(jié)果顯示，在一些國(guó)家和地區(qū)飲用水均存在溴酸鹽超標(biāo)問(wèn)題[2-5]。張永清等[6]對(duì)2008年1月至2010年9月《飲用天然礦泉水》國(guó)標(biāo)實(shí)施前后礦泉水中銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）及溴酸鹽污染情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2008年1月至2009年9月國(guó)標(biāo)實(shí)施前，35份（來(lái)自13家企業(yè)）水源水和48份（來(lái)自20家企業(yè)）成品水中銅綠假單胞菌超標(biāo)率分別為11.43%和35.42%，520份（來(lái)自59家企業(yè)）礦泉水成品水中溴酸鹽超標(biāo)率為42.12%；2009年10月至2010年9月國(guó)標(biāo)實(shí)施后，33份（來(lái)自20家企業(yè)）水源水和34份（來(lái)自27家企業(yè)）成品水銅綠假單胞菌超標(biāo)率分別為30.30%和17.65%，105份（來(lái)自46家企業(yè)）礦泉水成品水中溴酸鹽超標(biāo)率為18.10%。國(guó)標(biāo)的實(shí)施使礦泉水成品水中銅綠假單胞菌和溴酸鹽超標(biāo)現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，但仍然存在。因此，優(yōu)化飲用水臭氧工藝，使之達(dá)到既能有效殺滅致病菌又能控制消毒副產(chǎn)物溴酸鹽超標(biāo)產(chǎn)生的目的，對(duì)于飲用水生產(chǎn)具有重要意義。

本研究針對(duì)天然礦泉水中的2種致病菌指標(biāo)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和糞鏈球菌（Streptococcus faecium），采用懸液定量殺菌試驗(yàn)和流動(dòng)殺菌試驗(yàn)研究了臭氧對(duì)二者的殺滅效果，為飲用水生產(chǎn)中致病菌和溴酸鹽的有效控制、進(jìn)行臭氧消毒工藝的優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）臭氧殺滅效果也進(jìn)行了一定的研究，為臭氧消毒技術(shù)的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)菌株為大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212，由廣東省微生物研究所微生物檢測(cè)新技術(shù)研究發(fā)展中心提供。蠕動(dòng)泵（蘭格YZ1515x型）購(gòu)自保定蘭格恒流泵有限公司；臭氧發(fā)生器（OZ-3G型）購(gòu)自廣州市康利科技有限公司；便攜式臭氧檢測(cè)儀（HKM型）購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋制成菌懸液。

1.2.2 臭氧水的制備 將OZ-3G型臭氧發(fā)生器利用空氣源氧氣產(chǎn)生臭氧，由氣體分散器通入超純水，制備不同濃度的臭氧水。

1.2.3 臭氧濃度的測(cè)定 采用國(guó)標(biāo)N，N-二乙基-1，4-苯二胺（DPD）方法（GB11898-89），臭氧與DPD試劑反應(yīng)，樣品溶液呈紅色，利用便攜式臭氧檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 中和劑鑒定試驗(yàn) 以大腸桿菌ATCC8099為代表，按《消毒技術(shù)規(guī)范2002》要求，試驗(yàn)設(shè)計(jì)6組，以懸液定量殺菌試驗(yàn)程序進(jìn)行中和劑鑒定。試驗(yàn)結(jié)果，第1組無(wú)菌落生長(zhǎng)或僅有極少數(shù)菌落生長(zhǎng)；第 2組較第1組多，但較第3、4、5組為較少的菌落生長(zhǎng)；第3、4、5組有相似量試驗(yàn)菌落生長(zhǎng)，菌懸液濃度在1×107～5×107 CFU/mL，其組間菌落數(shù)誤差率應(yīng)不超過(guò)15%；第6組無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明所用中和劑及其濃度適宜。

1.2.5 懸液定量殺菌試驗(yàn) 吸取一定濃度的臭氧水4.5 mL于含有0.5 mL菌懸液的無(wú)菌試管內(nèi)，用漩渦混合器混合10 s；靜止放置，作用至預(yù)定時(shí)間；吸取0.5 mL至4.5 mL中和劑試管中混勻，中和作用10 min后取樣液0.5 mL進(jìn)行10倍稀釋，選擇合適稀釋度取0.5 mL接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算平均存活率。每管接兩個(gè)平皿。對(duì)照組以4.5 mL無(wú)菌水代替臭氧水。試驗(yàn)重復(fù)3次。

平均存活率=M1/M0×100%

式中，M0為對(duì)照組平均活菌量，CFU/mL；M1為試驗(yàn)組平均活菌量，CFU/mL。

1.2.6 流動(dòng)殺菌試驗(yàn) 用容量大于3 000 mL的燒杯，盛裝3 000 mL無(wú)菌水樣，用移液管滴入制備好的菌懸液，制成含菌量為1×104～2×105 CFU/mL的原溶液進(jìn)行殺菌試驗(yàn)，并取樣作為對(duì)照，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)裝置如圖1所示。含有不同試驗(yàn)菌的原溶液在蠕動(dòng)泵的作用下流動(dòng)經(jīng)過(guò)玻璃柱；開啟臭氧發(fā)生器，開始消毒處理，通過(guò)調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵流速控制臭氧接觸時(shí)間。待系統(tǒng)穩(wěn)定工作10 min后，在取樣口取樣測(cè)定臭氧濃度。另取5 mL溶液作為樣品立刻進(jìn)行微生物測(cè)定：吸取0.5 mL樣品至4.5 mL中和劑試管中混勻，中和作用10 min；中和后取樣液0.5 mL進(jìn)行10倍稀釋，選擇合適濃度取0.5 mL接種于平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算平均存活率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)證明（表1），含硫代硫酸鈉5 g/L的PBS 溶液組間菌落總數(shù)誤差為8.58%，小于15%的要求，符合濃度為0.56 mg/L的臭氧中和劑的要求。

2.2 懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組平均菌數(shù)，大腸桿菌為1.31×106 CFU/mL，銅綠假單胞菌為2.3×105 CFU/mL，糞鏈球菌為8.5×105 CFU/mL。懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果（圖2-圖4）表明，隨臭氧濃度的增加和接觸時(shí)間的延長(zhǎng)微生物的存活率降低。當(dāng)臭氧濃度低于0.30 mg/L，接觸時(shí)間10 min時(shí)，臭氧的殺滅效果從強(qiáng)到弱依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞鏈球菌，其存活率糞鏈球菌最大（75.55%）。說(shuō)明臭氧濃度低于0.30 mg/L時(shí)，作用10 min對(duì)這3種微生物殺滅效果不好。

接觸時(shí)間10 min時(shí)，臭氧濃度為0.55 mg/L，大腸桿菌存活率在2.00%以下；而臭氧濃度為0.50 mg/L，銅綠假單胞菌和糞鏈球菌存活率均小于0.10%。對(duì)于銅綠假單胞菌，臭氧濃度在0.36 mg/L，接觸10 min存活率即小于1.00 %。對(duì)于糞鏈球菌，臭氧濃度在0.31 mg/L，臭氧作用3 min即可使其存活率小于0.10%。

2.3 流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果

用去離子水作為無(wú)菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對(duì)照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，接觸時(shí)間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時(shí)，臭氧對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，無(wú)芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動(dòng)物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來(lái)，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實(shí)施的飲用天然礦泉水新國(guó)標(biāo)中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國(guó)標(biāo)實(shí)施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應(yīng)加強(qiáng)銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時(shí)，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時(shí)，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時(shí)銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對(duì)于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過(guò)程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時(shí)間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)臭氧濃度在0.30 mg/L以上時(shí)，3種菌對(duì)臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時(shí)，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時(shí)存活率均小于0.10%。因此，臭氧應(yīng)用于大腸桿菌的消毒殺菌時(shí)，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時(shí)間要大于5 min。

參考文獻(xiàn)：

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[9] 張永清. 包裝飲用水臭氧滅菌機(jī)理及其消毒副產(chǎn)物溴酸鹽控制技術(shù)研究[D]. 武漢：中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，2011.

2.3 流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果

用去離子水作為無(wú)菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對(duì)照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，接觸時(shí)間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時(shí)，臭氧對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，無(wú)芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動(dòng)物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來(lái)，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實(shí)施的飲用天然礦泉水新國(guó)標(biāo)中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國(guó)標(biāo)實(shí)施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應(yīng)加強(qiáng)銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時(shí)，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時(shí)，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時(shí)銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對(duì)于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過(guò)程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時(shí)間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)臭氧濃度在0.30 mg/L以上時(shí)，3種菌對(duì)臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時(shí)，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時(shí)存活率均小于0.10%。因此，臭氧應(yīng)用于大腸桿菌的消毒殺菌時(shí)，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時(shí)間要大于5 min。

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[9] 張永清. 包裝飲用水臭氧滅菌機(jī)理及其消毒副產(chǎn)物溴酸鹽控制技術(shù)研究[D]. 武漢：中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，2011.

2.3 流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果

用去離子水作為無(wú)菌水樣配制的原溶液中，大腸桿菌ATCC8099、銅綠假單胞菌ATCC27853和糞鏈球菌ATCC29212的對(duì)照組平均菌數(shù)分別為1.21×104、1.12×104和1.71×105（CFU/mL）。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，接觸時(shí)間為3、5或10 min，去離子水配制原溶液中臭氧濃度在0.20～0.60 mg/L時(shí)，臭氧對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的存活率在0.01%以下，即殺滅率均在99.99%以上。

3 小結(jié)與討論

銅綠假單胞菌又稱為綠膿桿菌，單生鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑，無(wú)芽胞，專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，為條件致病菌。在自然界分布廣泛，存在于水、土壤、空氣以及人和動(dòng)物皮膚及腸道中，為食品的主要污染源之一[7]。近年來(lái)，飲用天然礦泉水銅綠假單胞菌污染情況日漸受到重視，2009年10月1日開始實(shí)施的飲用天然礦泉水新國(guó)標(biāo)中，該菌已被列入新增加的3種致病菌之一（GB8537-2008）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，礦泉水水源水和成品水均存在銅綠假單胞菌污染現(xiàn)象[6，8]，國(guó)標(biāo)實(shí)施后水源水污染為造成成品水污染的主要原因[6]。因此，應(yīng)加強(qiáng)銅綠假單胞菌的污染控制。銅綠假單胞菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果顯示， 0.50 mg/L濃度臭氧殺滅3 min時(shí)，其存活率為0.02%，與糞鏈球菌效果相似；0.36 mg/L濃度的臭氧殺滅10 min時(shí)，銅綠假單胞菌存活率小于1.00%。糞鏈球菌的懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，0.31 mg/L濃度的臭氧殺滅3 min即可使其存活率小于0.10%。流動(dòng)殺菌試驗(yàn)表明，0.20～0.60 mg/L臭氧作用3 min時(shí)銅綠假單胞菌的存活率即小于0.01%。結(jié)合礦泉水臭氧消毒中溴酸鹽的形成研究結(jié)果[9]，對(duì)于礦泉水中的致病菌銅綠假單胞菌和糞鏈球菌，消毒過(guò)程中控制致病菌和溴酸鹽的最佳臭氧濃度為0.3～0.4 mg/L，臭氧接觸時(shí)間小于5 min。

懸液定量殺菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)臭氧濃度在0.30 mg/L以上時(shí)，3種菌對(duì)臭氧的抗性從大到小依次為大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌。作用10 min，0.55 mg/L濃度臭氧時(shí)，大腸桿菌存活率在2.00%以下，而銅綠假單胞菌和糞鏈球菌在臭氧濃度0.50 mg/L時(shí)存活率均小于0.10%。因此，臭氧應(yīng)用于大腸桿菌的消毒殺菌時(shí)，為了取得較好的殺菌效果，其濃度要高于0.40 mg/L，作用時(shí)間要大于5 min。

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