劉蘭泉，王東（等）

摘要：為篩選出針對防治萬州區(qū)獼猴桃（Actinidia chinensis）潰瘍病菌的高效藥劑，將初篩出的10種常見商品殺菌劑分別采用紙碟法和平板劃線法進行室內(nèi)抑菌試驗，進一步篩選出6種抑菌效果較好的藥劑進行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，乙蒜氯霉的抑菌效果最好，EC50為36.34 mg/L；其次是新田秀才6號、農(nóng)用硫酸鏈霉素，其EC50分別為83.21、92.34 mg/L。

關(guān)鍵詞：獼猴桃（Actinidia chinensis）；潰瘍病；殺菌劑；毒力

中圖分類號：S482.2；S663.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1560-03

Indoor Screening of Bactericides against Kiwifruit Canker in Wanzhou Distict

LIU Lan-quan，WANG Dong，LIU Lu，QIN Gui-yong，WU Qiong

（Department of Agriculture and Forestry Science and Technology，Chongqing Three Gorges Polytechnic College，

Chongqing 404155，China）

Abstract： In order to screen the highly efficient medicines against the Kiwifruit canker in Wanzhou district， 10 preliminarily screened common medicines were used for indoor antibacterial tests with paper plates and plate streaking method. 6 kinds of medicine with relatively better antibacterial effect were selected for indoor virulence test. The results showed that Chloramphenicol B. garlic had the best antibacterial effects with the EC50 of 36.34 mg/L， followed by the New Tianxiucai No.6 and agricultural streptomycin sulphate ranking the second and third with the EC50 of 83.21 mg/L and 92.34 mg/L， respectively.

Key words： Actinidia chinensis； canker； bactericide； toxicity

獼猴桃潰瘍病是獼猴桃（Actinidia chinensis）生產(chǎn)上的重要病害之一，主要危害主干枝條、花及葉片，可引起枝干潰瘍或枝葉萎蔫死亡，可致葉片產(chǎn)生暗褐色不規(guī)則病斑[1]。獼猴桃潰瘍病于1980年在美國加利福尼亞州和日本神州靜岡縣發(fā)現(xiàn)，中國最早于1986年在湖南省東山峰農(nóng)場發(fā)現(xiàn)[2]，隨后安徽、四川、福建、陜西等省相繼報道此病的發(fā)生，并將該病列為全國森林植物檢疫對象[3-5]。目前萬州區(qū)大面積栽種獼猴桃，生產(chǎn)過程中潰瘍病發(fā)生嚴重，個別果園甚至面臨毀園的局面，給萬州區(qū)獼猴桃生產(chǎn)帶來巨大威脅。雖然國內(nèi)外關(guān)于此病的報道較多，但由于各地理區(qū)域氣候等條件不盡相同，不能照搬套用其防治技術(shù)。為做好萬州區(qū)獼猴桃潰瘍病的防治工作，本研究初步進行了防治藥劑的室內(nèi)篩選，以期為萬州區(qū)獼猴桃潰瘍病的防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：供試獼猴桃潰瘍病菌株分離自萬州區(qū)獼猴桃潰瘍病重發(fā)區(qū)病部樣品。

供試藥劑：81%乙蒜氯霉EC（天津漢邦植物保護劑有限公司）、新田秀才6號EC（上海新田秀才生物科技有限公司）、72%農(nóng)用硫酸鏈霉素PX（成都普惠生物工程有限公司）、3 000億/g熒光假單胞桿菌DP（江蘇省常州蘭陵制藥有限公司）、6%春雷霉素WP（湯普森生物科技有限公司）、3%中生菌素WP（福建凱立生物制品有限公司）、53.8%銅制劑WDG（鄭州志信農(nóng)化有限公司）、77%硫酸銅鈣WP（西班牙艾克威化學工業(yè)有限公司）、40%甲霜靈WP（福建新農(nóng)大正生物工程有限公司）、20%葉枯唑EC（東莞市瑞德豐生物科技有限公司）。

供試培養(yǎng)基（NA培養(yǎng)基）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0，培養(yǎng)基121～126 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離純化 用消毒后的解剖刀將發(fā)病獼猴桃枝條潰瘍處表面皮層輕輕刮去，剝下小塊內(nèi)部褐色組織于75%乙醇中浸泡10 s，再放入0.1%氯化汞溶液中消毒40 s后取出，轉(zhuǎn)放入無菌水中漂洗3次。洗凈后將組織塊放入無菌培養(yǎng)皿中，滴入2滴無菌水，用無菌玻棒搗碎，靜置5 min，用玻棒蘸取菌液在NA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h。待長出菌落后，挑取圓形、稍隆起、黃白色稀湯狀、有光澤的菌落于NA培養(yǎng)基上純化3次，再挑取單一菌落置于NA斜面中，于室溫中保存。

1.2.2 菌懸液的配制 活化供試菌于28 ℃培養(yǎng)48 h后，用無菌水配制成病菌原液，取1 mL原液用無菌水按10、100、1 000倍稀釋后涂于NA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)平板上長出的菌落數(shù)推算出病菌原液濃度。選擇1 mL菌懸液涂板后長出的菌落數(shù)為100個左右的濃度，并按此制備出菌懸液。

1.2.3 室內(nèi)抑菌試驗 室內(nèi)抑菌試驗分別采用紙碟法和平板劃線法進行測定[6，7]。

1）紙碟法。將配制好的菌懸液與NA培養(yǎng)基（約45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培養(yǎng)基后迅速倒入無菌培養(yǎng)皿。將各供試藥劑用無菌水分別稀釋成100、200、400倍的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每皿放置1片紙碟，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照。28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小。

2）平板劃線法。分別配制稀釋400、800、1 600倍的各供試藥劑NA培養(yǎng)基，每種濃度設置3個平板（分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含藥的NA平板培養(yǎng)基作為對照。將已活化的供試菌在各平板上劃“井”字。28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。

1.2.4 藥劑室內(nèi)毒力測定 經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗，篩選出抑菌效果較好的藥劑進一步進行室內(nèi)毒力測定。按室內(nèi)抑菌試驗的紙碟法，配置好帶菌培養(yǎng)基。在預試驗基礎上，將各供試藥劑配置成相應濃度梯度的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照（CK）。28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌帶寬度。所得結(jié)果用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計算，得出各藥劑的毒力回歸方程式和EC50。

抑菌率=[（處理皿中抑菌帶寬-對照皿中抑菌帶寬）/（對照皿中菌落覆蓋圈半徑-紙碟半徑）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果

室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果中，無論是采用紙碟法還是平板劃線法，各供試藥劑對獼猴桃潰瘍病原菌的抑制作用差異均較大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，紙碟法試驗中3種稀釋倍數(shù)條件下所產(chǎn)生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次為新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，100倍稀釋條件下產(chǎn)生的抑菌圈均為1.8 cm；春雷霉素、銅制劑、熒光假單胞桿菌、硫酸銅鈣的抑菌效果較差。平板劃線法試驗中，乙蒜氯霉效果最好，所有濃度均無生長；其次為新田秀才6號、農(nóng)用硫酸鏈霉素、中生菌素及葉枯唑，僅1 600倍稀釋藥液的處理中有零星病菌生長。

2.2 藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗后，篩選出對獼猴桃潰瘍病菌抑制效果較好的6種藥劑，分別進行室內(nèi)毒力測定，所得EC50的大小是衡量藥劑毒力大小的重要指標，EC50越小表明藥劑的毒力越強。各試驗藥劑的抑菌效果差異明顯（表3），乙蒜氯霉對獼猴桃潰瘍病菌的抑制效果最好，EC50為36.34 mg/L；其次為新田秀才5號和農(nóng)用硫酸鏈霉素，EC50分別為83.21 mg/L和92.34 mg/L。銅制劑、熒光假單胞桿菌和硫酸銅鈣的效果較差，EC50均超過1 000 mg/L。

3 小結(jié)與討論

獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性病害，該病在萬州發(fā)生日益嚴重，目前尚沒有一種方法能夠有效控制，該病如不及時防治，易在短時期內(nèi)暴發(fā)成災。目前化學藥劑防治仍是獼猴桃潰瘍病的重要防治措施，盡管其存在抗藥性及環(huán)境污染等方面的問題，但從目前的發(fā)展情況來看，化學防治仍占主導地位。本研究通過對多種常見殺菌劑進行室內(nèi)抑菌試驗及室內(nèi)毒力測定，以期能找到有效防治萬州獼猴桃潰瘍病菌的針對性藥劑。

殺菌劑的防治可分為化學保護、化學治療和化學免疫。殺菌劑毒力測定通常是在特定條件下進行，其結(jié)果可作為評估藥劑效果的一個重要參考值[8]。本試驗篩選出了乙蒜氯霉、新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，證明這3種藥劑對萬州獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用均較好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生產(chǎn)中，可選用這3種藥劑直接對獼猴桃潰瘍病進行施藥，但在實際施藥過程中，還應考慮施藥時間、田間氣候條件等因素。為延緩植物抗藥性的產(chǎn)生，建議應將此3種藥劑交替使用。

參考文獻：

[1] 黃宏文.獼猴桃研究進展[M].北京：科學出版社，2000.

[2] 雷 慶.獼猴桃潰瘍病的病原分類、噬菌體及發(fā)生規(guī)律研究[D].四川雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2007.

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[6] 張 鋒，陳志杰，張淑蓮，等.獼猴桃潰瘍病藥劑防治技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2005，33（3）：71-75.

[7] 嚴 杰，羅海波，陸德源.現(xiàn)代微生物學實驗技術(shù)及其應用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

[8] 姚廷山，周常勇，胡軍華，等.3種殺菌劑對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)毒力測定[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2009，31（6）：1026-1029.

1.2.3 室內(nèi)抑菌試驗 室內(nèi)抑菌試驗分別采用紙碟法和平板劃線法進行測定[6，7]。

1）紙碟法。將配制好的菌懸液與NA培養(yǎng)基（約45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培養(yǎng)基后迅速倒入無菌培養(yǎng)皿。將各供試藥劑用無菌水分別稀釋成100、200、400倍的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每皿放置1片紙碟，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照。28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小。

2）平板劃線法。分別配制稀釋400、800、1 600倍的各供試藥劑NA培養(yǎng)基，每種濃度設置3個平板（分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含藥的NA平板培養(yǎng)基作為對照。將已活化的供試菌在各平板上劃“井”字。28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。

1.2.4 藥劑室內(nèi)毒力測定 經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗，篩選出抑菌效果較好的藥劑進一步進行室內(nèi)毒力測定。按室內(nèi)抑菌試驗的紙碟法，配置好帶菌培養(yǎng)基。在預試驗基礎上，將各供試藥劑配置成相應濃度梯度的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照（CK）。28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌帶寬度。所得結(jié)果用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計算，得出各藥劑的毒力回歸方程式和EC50。

抑菌率=[（處理皿中抑菌帶寬-對照皿中抑菌帶寬）/（對照皿中菌落覆蓋圈半徑-紙碟半徑）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果

室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果中，無論是采用紙碟法還是平板劃線法，各供試藥劑對獼猴桃潰瘍病原菌的抑制作用差異均較大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，紙碟法試驗中3種稀釋倍數(shù)條件下所產(chǎn)生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次為新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，100倍稀釋條件下產(chǎn)生的抑菌圈均為1.8 cm；春雷霉素、銅制劑、熒光假單胞桿菌、硫酸銅鈣的抑菌效果較差。平板劃線法試驗中，乙蒜氯霉效果最好，所有濃度均無生長；其次為新田秀才6號、農(nóng)用硫酸鏈霉素、中生菌素及葉枯唑，僅1 600倍稀釋藥液的處理中有零星病菌生長。

2.2 藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗后，篩選出對獼猴桃潰瘍病菌抑制效果較好的6種藥劑，分別進行室內(nèi)毒力測定，所得EC50的大小是衡量藥劑毒力大小的重要指標，EC50越小表明藥劑的毒力越強。各試驗藥劑的抑菌效果差異明顯（表3），乙蒜氯霉對獼猴桃潰瘍病菌的抑制效果最好，EC50為36.34 mg/L；其次為新田秀才5號和農(nóng)用硫酸鏈霉素，EC50分別為83.21 mg/L和92.34 mg/L。銅制劑、熒光假單胞桿菌和硫酸銅鈣的效果較差，EC50均超過1 000 mg/L。

3 小結(jié)與討論

獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性病害，該病在萬州發(fā)生日益嚴重，目前尚沒有一種方法能夠有效控制，該病如不及時防治，易在短時期內(nèi)暴發(fā)成災。目前化學藥劑防治仍是獼猴桃潰瘍病的重要防治措施，盡管其存在抗藥性及環(huán)境污染等方面的問題，但從目前的發(fā)展情況來看，化學防治仍占主導地位。本研究通過對多種常見殺菌劑進行室內(nèi)抑菌試驗及室內(nèi)毒力測定，以期能找到有效防治萬州獼猴桃潰瘍病菌的針對性藥劑。

殺菌劑的防治可分為化學保護、化學治療和化學免疫。殺菌劑毒力測定通常是在特定條件下進行，其結(jié)果可作為評估藥劑效果的一個重要參考值[8]。本試驗篩選出了乙蒜氯霉、新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，證明這3種藥劑對萬州獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用均較好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生產(chǎn)中，可選用這3種藥劑直接對獼猴桃潰瘍病進行施藥，但在實際施藥過程中，還應考慮施藥時間、田間氣候條件等因素。為延緩植物抗藥性的產(chǎn)生，建議應將此3種藥劑交替使用。

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[4] 劉紹基，王忠肅，唐顯富，等.四川省蒼溪獼猴桃潰瘍病的發(fā)生規(guī)律[J].中國果樹，1996（1）：25-26.

[5] 宋曉斌，王培新，張星耀，等.陜西獼猴桃病蟲害發(fā)生與危害的調(diào)查分析[J].西北林學院學報，1998，13（3）：79-84.

[6] 張 鋒，陳志杰，張淑蓮，等.獼猴桃潰瘍病藥劑防治技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2005，33（3）：71-75.

[7] 嚴 杰，羅海波，陸德源.現(xiàn)代微生物學實驗技術(shù)及其應用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

[8] 姚廷山，周常勇，胡軍華，等.3種殺菌劑對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)毒力測定[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2009，31（6）：1026-1029.

1.2.3 室內(nèi)抑菌試驗 室內(nèi)抑菌試驗分別采用紙碟法和平板劃線法進行測定[6，7]。

1）紙碟法。將配制好的菌懸液與NA培養(yǎng)基（約45 ℃）以V/V=1∶9的比例混合，制成混菌培養(yǎng)基后迅速倒入無菌培養(yǎng)皿。將各供試藥劑用無菌水分別稀釋成100、200、400倍的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每皿放置1片紙碟，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照。28 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈大小。

2）平板劃線法。分別配制稀釋400、800、1 600倍的各供試藥劑NA培養(yǎng)基，每種濃度設置3個平板（分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），以不含藥的NA平板培養(yǎng)基作為對照。將已活化的供試菌在各平板上劃“井”字。28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長情況。

1.2.4 藥劑室內(nèi)毒力測定 經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗，篩選出抑菌效果較好的藥劑進一步進行室內(nèi)毒力測定。按室內(nèi)抑菌試驗的紙碟法，配置好帶菌培養(yǎng)基。在預試驗基礎上，將各供試藥劑配置成相應濃度梯度的藥液，將直徑為5 mm的圓形無菌濾紙片放入不同濃度的藥液中充分浸濕，置于混菌培養(yǎng)基平板中心，每種濃度設3次重復，以浸濕無菌水的紙碟作為對照（CK）。28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌帶寬度。所得結(jié)果用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計算，得出各藥劑的毒力回歸方程式和EC50。

抑菌率=[（處理皿中抑菌帶寬-對照皿中抑菌帶寬）/（對照皿中菌落覆蓋圈半徑-紙碟半徑）]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果

室內(nèi)抑菌試驗結(jié)果中，無論是采用紙碟法還是平板劃線法，各供試藥劑對獼猴桃潰瘍病原菌的抑制作用差異均較大（表1、表2）。其中乙蒜氯霉效果最好，紙碟法試驗中3種稀釋倍數(shù)條件下所產(chǎn)生的抑菌圈均大于等于2.2 cm；其次為新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，100倍稀釋條件下產(chǎn)生的抑菌圈均為1.8 cm；春雷霉素、銅制劑、熒光假單胞桿菌、硫酸銅鈣的抑菌效果較差。平板劃線法試驗中，乙蒜氯霉效果最好，所有濃度均無生長；其次為新田秀才6號、農(nóng)用硫酸鏈霉素、中生菌素及葉枯唑，僅1 600倍稀釋藥液的處理中有零星病菌生長。

2.2 藥劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果

經(jīng)過室內(nèi)抑菌試驗后，篩選出對獼猴桃潰瘍病菌抑制效果較好的6種藥劑，分別進行室內(nèi)毒力測定，所得EC50的大小是衡量藥劑毒力大小的重要指標，EC50越小表明藥劑的毒力越強。各試驗藥劑的抑菌效果差異明顯（表3），乙蒜氯霉對獼猴桃潰瘍病菌的抑制效果最好，EC50為36.34 mg/L；其次為新田秀才5號和農(nóng)用硫酸鏈霉素，EC50分別為83.21 mg/L和92.34 mg/L。銅制劑、熒光假單胞桿菌和硫酸銅鈣的效果較差，EC50均超過1 000 mg/L。

3 小結(jié)與討論

獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性病害，該病在萬州發(fā)生日益嚴重，目前尚沒有一種方法能夠有效控制，該病如不及時防治，易在短時期內(nèi)暴發(fā)成災。目前化學藥劑防治仍是獼猴桃潰瘍病的重要防治措施，盡管其存在抗藥性及環(huán)境污染等方面的問題，但從目前的發(fā)展情況來看，化學防治仍占主導地位。本研究通過對多種常見殺菌劑進行室內(nèi)抑菌試驗及室內(nèi)毒力測定，以期能找到有效防治萬州獼猴桃潰瘍病菌的針對性藥劑。

殺菌劑的防治可分為化學保護、化學治療和化學免疫。殺菌劑毒力測定通常是在特定條件下進行，其結(jié)果可作為評估藥劑效果的一個重要參考值[8]。本試驗篩選出了乙蒜氯霉、新田秀才6號及農(nóng)用硫酸鏈霉素，證明這3種藥劑對萬州獼猴桃潰瘍病菌的抑制作用均較好，其中以乙蒜氯霉的效果最佳。在生產(chǎn)中，可選用這3種藥劑直接對獼猴桃潰瘍病進行施藥，但在實際施藥過程中，還應考慮施藥時間、田間氣候條件等因素。為延緩植物抗藥性的產(chǎn)生，建議應將此3種藥劑交替使用。

參考文獻：

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[6] 張 鋒，陳志杰，張淑蓮，等.獼猴桃潰瘍病藥劑防治技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2005，33（3）：71-75.

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[8] 姚廷山，周常勇，胡軍華，等.3種殺菌劑對柑橘潰瘍病菌的室內(nèi)毒力測定[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2009，31（6）：1026-1029.