黃妍，鞠璐寧

摘要：對(duì)米曲霉（Aspergillus oryaze）GN-2菌株產(chǎn)中性蛋白酶固體發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，米曲霉的固體適宜發(fā)酵條件為發(fā)酵原料麩皮∶豆粉為4∶1（質(zhì)量比，下同），培養(yǎng)時(shí)間60 h，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)基加水量10 mL，接種量1×106個(gè)/mL孢子懸液2.0 mL，培養(yǎng)基起始pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4溶液1 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，在溫度25 ℃、加水量20 mL、麩皮∶黃豆粉為4∶1、培養(yǎng)時(shí)間72 h的條件下酶活力最高，達(dá)1 016.9 U/g。

關(guān)鍵詞：米曲霉（Aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；產(chǎn)酶條件

中圖分類號(hào)：TQ925；Q93-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1637-04

Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease from

Aspergillus oryzae GN-2 Strain

HUANG Yan，JU Lu-ning

（Minbei Vocational and Technical College， Nanping 353000，F(xiàn)ujian，China）

Abstract： The optimal solid fermentation conditions of neutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1， fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 mL， inoculum amount 2.0 mL 1×106 spores/mL spore suspension， the initial medium pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃ for 72 h， water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1， with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.

Key words： Aspergillus oryzae； neutral protease； enzyme production conditions

中性蛋白酶是指最適作用pH介于6.0～7.5的一類蛋白酶，能催化蛋白質(zhì)肽鍵水解。它是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶制劑，被廣泛應(yīng)用于皮革脫毛、飼料加工、畜禽血液蛋白質(zhì)水解、酒和飲料的澄清以及醫(yī)藥治療等領(lǐng)域[1-3]。

米曲霉（Aspergillus oryaze）具有豐富的蛋白酶系，能產(chǎn)生酸性、中性和堿性蛋白酶，能耐受較高溫度，廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及飼料等工業(yè)中[4]。米曲霉易于固體培養(yǎng)，所產(chǎn)的中性蛋白酶熱穩(wěn)定性高，有利于酶制劑的制作和保存，培養(yǎng)原料來源廣泛，價(jià)格便宜，用于食品行業(yè)和化妝品行業(yè)將有廣泛的前景[5]。吳繼星等[6]研究表明，微生物培養(yǎng)基組成與產(chǎn)酶有極大的相關(guān)性。近年來，研究者采用正交設(shè)計(jì)的方法對(duì)培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，并取得一定成效[7]。

本研究從釀造醬油曲精中分離到一株米曲霉菌株，命名為GN-2，研究了培養(yǎng)條件對(duì)米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的影響，通過正交試驗(yàn)確定了其中4個(gè)影響因素的最優(yōu)組合，為該菌株的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源：米曲霉GN-2，從上海迪發(fā)釀造生物制品有限公司優(yōu)質(zhì)醬油曲精分離純化得到。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L。

豆粉汁培養(yǎng)基：MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，可溶性淀粉20 g/L，黃豆汁1 L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆粉3 g，麩皮12 g，去離子水15 mL，裝入250 mL三角瓶攪拌混合均勻。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：干酪素（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；L-酪氨酸（上海翔軍生物科技有限公司）；福林酚試劑（上海分子免疫生化實(shí)驗(yàn)室有限公司）。

主要儀器：YC-W型冷凍恒溫振蕩器（鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TGL-16M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；721E型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ALC-114型電子分析天平（北京賽多利儀器有限公司）；pH211C型臺(tái)式數(shù)顯酸堿度計(jì)（意大利HANNA）。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離純化 挑取2環(huán)曲精于100 mL無菌生理鹽水中，磁力攪拌器攪拌30 min打散孢子，采用稀釋平板涂布法對(duì)供試菌種進(jìn)行分離純化。培養(yǎng)后，挑取生長(zhǎng)快、產(chǎn)孢子致密、表面顏色一致的單菌落，移入PDA斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)后置于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 孢子懸液的制備 挑取斜面培養(yǎng)基米曲霉GN-2孢子兩環(huán)，于100 mL無菌生理鹽水中，磁力攪拌器攪拌30 min打散孢子，取樣置于光學(xué)顯微鏡下，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子密度約為1×106 個(gè)/mL。

1.3.3 發(fā)酵條件 取接種孢子懸液2.0 mL于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麩皮∶黃豆粉=4∶1，加水量為15 mL，裝料量15 g。

1.3.4 蛋白酶活力測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8]繪制L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定中性蛋白酶的活力。酶活力單位定義：40 ℃、pH 7.2條件下，每克米曲霉l min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)中性蛋白酶活力單位（U/g）。

1.3.5 發(fā)酵條件對(duì)米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的影響

1）發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，分別在24、36、48、60、72 h取樣，測(cè)定酶活力。

2）培養(yǎng)基組分。在總量不變前提下，控制發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮與黃豆粉的比例分別為1∶4、2∶3、1∶1、3∶2和4∶1，滅菌后接種培養(yǎng)，取樣測(cè)定酶活力。

3）培養(yǎng)基加水量。發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加水10、15、20、25、30 mL，其他發(fā)酵條件不變，滅菌后接種培養(yǎng)，取樣測(cè)定酶活力。

4）溫度。將接種后的發(fā)酵培養(yǎng)基分別置于20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定酶活力。

5）接種量。發(fā)酵培養(yǎng)基中加水量分別為14.5、14.0、13.5、13.0、12.5 mL，滅菌后分別接入0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL孢子懸液，培養(yǎng)后取樣測(cè)定酶活力。

6）培養(yǎng)基起始pH。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入適量的1 mol/L HCl或NaOH溶液，調(diào)整后使培養(yǎng)料的pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，滅菌接種后培養(yǎng)，取樣測(cè)定酶活力。

7）無機(jī)鹽。以15 mL下列無機(jī)鹽溶液：0.05% MgSO4·7H2O、0.1%K2HPO4、0.2%KNO3、0.001%FeSO4·7H2O和0.02%（NH4）2SO4，代替發(fā)酵培養(yǎng)基中的去離子水，滅菌接種后培養(yǎng)，取樣測(cè)定酶活力。

以上各試驗(yàn)每個(gè)處理3次重復(fù)。

8）發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，選擇培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基組分（麩皮∶豆粉）、加水量、培養(yǎng)溫度4個(gè)因素進(jìn)行發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)，按照L9（34）設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，9個(gè)組合，3次重復(fù)，優(yōu)化發(fā)酵條件。正交試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

1.3.6 粗酶液的制備 準(zhǔn)確稱取固體發(fā)酵樣品5 g于25 mL，pH 7.2的0.5 mol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻后于40 ℃恒溫振蕩鍋中，100 r/min浸提30 min。浸提液過濾后所得濾液即為粗酶液，用于后期測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2003和SPSS 15.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性分析采用多重比較法（LSD），數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在波長(zhǎng)680 nm處，酪氨酸濃度在10～80 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=0.092 9x+0.015 8，R2=0.991 5。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2結(jié)果表明，在試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，米曲霉GN-2菌株產(chǎn)中性蛋白酶活力呈先升高后降低的變化規(guī)律。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為60 h時(shí)，中性蛋白酶酶活力達(dá)到最高值，為（244.1±8.93） U/g。之后繼續(xù)培養(yǎng)，中性蛋白酶活力降低。

2.3 培養(yǎng)基組分對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖3結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中麩皮與黃豆粉的比例對(duì)米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶有明顯影響。麩皮所占比例越大，米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的酶活力越高。當(dāng)麩皮∶黃豆粉=4∶1時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，為（538.6±12.21） U/g。這可能與麩皮原料對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的誘導(dǎo)作用有關(guān)。

2.4 培養(yǎng)基加水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖4可以看出，培養(yǎng)基加水量對(duì)米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶有明顯影響。在本試驗(yàn)條件下，產(chǎn)酶最適加水量為10 mL，且隨著培養(yǎng)基加水量的增加，中性蛋白酶酶活力逐漸下降。可能一方面是由于培養(yǎng)基含水量過高，菌絲體前期徒長(zhǎng)，形成孢子的時(shí)間延長(zhǎng)，使中性蛋白酶產(chǎn)量下降；另一方面，培養(yǎng)基含水量過高致使培養(yǎng)基的透氣性下降，氧氣供給不足，使菌體生長(zhǎng)不良，產(chǎn)酶量也下降。

2.5 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖5可以看出，溫度對(duì)米曲霉的產(chǎn)酶能力有較大的影響。25 ℃以下，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量較少。溫度高于30 ℃時(shí)，產(chǎn)酶量迅速下降。培養(yǎng)溫度為25、30 ℃時(shí)，酶活力較高。當(dāng)培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高值，為（635.6±16.31） U/g。當(dāng)培養(yǎng)溫度為40 ℃時(shí)，可能由于固體發(fā)酵料中心熱量不能及時(shí)擴(kuò)散，導(dǎo)致燒曲現(xiàn)象，以至酶活力降到最低點(diǎn)，約為最高值的4.57%。

2.6 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

表2結(jié)果表明，接種量可影響米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的活力。隨著接種量的增加，米曲霉產(chǎn)酶能力呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)；當(dāng)接種量為2.0 mL時(shí)，中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到（656.3±16.64） U/g。可能是因?yàn)榻臃N量過小時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵遲緩；接種量過大時(shí)，則因菌體生長(zhǎng)過快導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)和氧氣缺乏，從而影響酶的產(chǎn)生[3]。

2.7 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

表3結(jié)果表明，培養(yǎng)基起始pH對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶有一定影響。隨著培養(yǎng)基起始pH的增大，中性蛋白酶酶活力呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；pH 為6.0時(shí)，酶活力最高，達(dá)到（589.4±15.22） U/g。pH為7.0時(shí)，酶活力下降到（461.5±13.85） U/g。當(dāng)pH為9.0時(shí)，酶活力降低到最小值，為（315.9±11.76） U/g。

2.8 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表4可知，無機(jī)鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶也有影響，Mg2+、K+、NH4+對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。當(dāng)無機(jī)鹽為0.02%（NH4）2SO4溶液時(shí)，中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到（859.6±16.34） U/g。

2.9 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中各組分的配比與培養(yǎng)條件。由表5可知，試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A1B3C3D3，米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組分麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)溫度25 ℃、加水量20 mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h。極差分析可知，各因子對(duì)酶活力影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間、加水量。方差分析（表6）表明，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響顯著，而發(fā)酵培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間以及加水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響不顯著。按照最佳組合試驗(yàn)得到的酶活力為1 016.9 U/g。

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)表明，固體發(fā)酵的適合產(chǎn)酶條件為麩皮∶黃豆粉為 4∶1，發(fā)酵時(shí)間 60 h，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)基加水量10 mL，接種量2.0 mL孢子懸液，培養(yǎng)基起始pH 6.0，無機(jī)鹽0.02%（NH4）2SO4 1 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為25 ℃、加水量為20 mL、麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)時(shí)間為72 h 的組合酶活力最高，達(dá)1 016.9 U/g。筆者在后續(xù)試驗(yàn)中采用該正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件，進(jìn)行了3次發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果酶活力均值為（993.6±14.62） U/g。說明經(jīng)過優(yōu)化，酶活力得到了提高。

中性蛋白酶可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過微生物生產(chǎn)。由于動(dòng)植物資源受到各種條件的限制，不易擴(kuò)大生產(chǎn)。而微生物具有生長(zhǎng)快、種類多等優(yōu)點(diǎn)，且微生物易變異，通過菌種改良可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量，改善酶的生產(chǎn)和酶的性質(zhì)，因此目前工業(yè)酶制劑大部分都是通過微生物發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模制造的?？梢陨a(chǎn)蛋白酶的微生物有細(xì)菌、放線菌和真菌等。米曲霉可以生產(chǎn)多種酶，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，中性蛋白酶為其中的一種。米曲霉是一種常用的酶制劑生產(chǎn)菌種。本試驗(yàn)主要探討了多種因素對(duì)米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響，得到的試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果[4，5]基本一致。但是若要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，需要根據(jù)具體情況選擇合適的條件。

在生產(chǎn)中，若能夠提高菌株的產(chǎn)酶能力，則可節(jié)約生產(chǎn)成本，獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，有研究者通過理化因子誘變或者基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良處理，篩選得到一些產(chǎn)酶能力較高的菌株。由于誘變具有不定向性，因此這方面的研究有待進(jìn)一步深入。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳武勇，辜海兵，秦 濤，等.中性蛋白酶水解鉻革屑的研究[J].中國(guó)皮革，2001，30（21）：2-5.

[2] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（3）：154-155.

[3] 張 敏，趙 從，路福平，等.產(chǎn)中性蛋白酶菌株發(fā)酵條件的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007（12）：44-48.

[4] 楊世平，邱德全.米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的適宜條件[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（3）：47-51.

[5] 蘇 龍，陳顯玲，李家洲.米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶產(chǎn)酶條件研究[J].玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（5）：86-89.

[6] 吳繼星，陳在餌，張志剛.蘇云金桿菌WG-001工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：91-94.

[7] 肖懷秋，林親錄，李玉珍，等.產(chǎn)中性蛋白酶B4發(fā)酵條件的研究[J].食品與生物技術(shù)，2004，20（5）：23-25.

[8] 天津輕工業(yè)學(xué)院，大連輕工業(yè)學(xué)院，無錫輕工業(yè)學(xué)院.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1986.

2.7 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

表3結(jié)果表明，培養(yǎng)基起始pH對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶有一定影響。隨著培養(yǎng)基起始pH的增大，中性蛋白酶酶活力呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；pH 為6.0時(shí)，酶活力最高，達(dá)到（589.4±15.22） U/g。pH為7.0時(shí)，酶活力下降到（461.5±13.85） U/g。當(dāng)pH為9.0時(shí)，酶活力降低到最小值，為（315.9±11.76） U/g。

2.8 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表4可知，無機(jī)鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶也有影響，Mg2+、K+、NH4+對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。當(dāng)無機(jī)鹽為0.02%（NH4）2SO4溶液時(shí)，中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到（859.6±16.34） U/g。

2.9 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中各組分的配比與培養(yǎng)條件。由表5可知，試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A1B3C3D3，米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組分麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)溫度25 ℃、加水量20 mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h。極差分析可知，各因子對(duì)酶活力影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間、加水量。方差分析（表6）表明，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響顯著，而發(fā)酵培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間以及加水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響不顯著。按照最佳組合試驗(yàn)得到的酶活力為1 016.9 U/g。

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)表明，固體發(fā)酵的適合產(chǎn)酶條件為麩皮∶黃豆粉為 4∶1，發(fā)酵時(shí)間 60 h，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)基加水量10 mL，接種量2.0 mL孢子懸液，培養(yǎng)基起始pH 6.0，無機(jī)鹽0.02%（NH4）2SO4 1 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為25 ℃、加水量為20 mL、麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)時(shí)間為72 h 的組合酶活力最高，達(dá)1 016.9 U/g。筆者在后續(xù)試驗(yàn)中采用該正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件，進(jìn)行了3次發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果酶活力均值為（993.6±14.62） U/g。說明經(jīng)過優(yōu)化，酶活力得到了提高。

中性蛋白酶可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過微生物生產(chǎn)。由于動(dòng)植物資源受到各種條件的限制，不易擴(kuò)大生產(chǎn)。而微生物具有生長(zhǎng)快、種類多等優(yōu)點(diǎn)，且微生物易變異，通過菌種改良可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量，改善酶的生產(chǎn)和酶的性質(zhì)，因此目前工業(yè)酶制劑大部分都是通過微生物發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模制造的?？梢陨a(chǎn)蛋白酶的微生物有細(xì)菌、放線菌和真菌等。米曲霉可以生產(chǎn)多種酶，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，中性蛋白酶為其中的一種。米曲霉是一種常用的酶制劑生產(chǎn)菌種。本試驗(yàn)主要探討了多種因素對(duì)米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響，得到的試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果[4，5]基本一致。但是若要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，需要根據(jù)具體情況選擇合適的條件。

在生產(chǎn)中，若能夠提高菌株的產(chǎn)酶能力，則可節(jié)約生產(chǎn)成本，獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，有研究者通過理化因子誘變或者基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良處理，篩選得到一些產(chǎn)酶能力較高的菌株。由于誘變具有不定向性，因此這方面的研究有待進(jìn)一步深入。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳武勇，辜海兵，秦 濤，等.中性蛋白酶水解鉻革屑的研究[J].中國(guó)皮革，2001，30（21）：2-5.

[2] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（3）：154-155.

[3] 張 敏，趙 從，路福平，等.產(chǎn)中性蛋白酶菌株發(fā)酵條件的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007（12）：44-48.

[4] 楊世平，邱德全.米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的適宜條件[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（3）：47-51.

[5] 蘇 龍，陳顯玲，李家洲.米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶產(chǎn)酶條件研究[J].玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（5）：86-89.

[6] 吳繼星，陳在餌，張志剛.蘇云金桿菌WG-001工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：91-94.

[7] 肖懷秋，林親錄，李玉珍，等.產(chǎn)中性蛋白酶B4發(fā)酵條件的研究[J].食品與生物技術(shù)，2004，20（5）：23-25.

[8] 天津輕工業(yè)學(xué)院，大連輕工業(yè)學(xué)院，無錫輕工業(yè)學(xué)院.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1986.

2.7 培養(yǎng)基起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

表3結(jié)果表明，培養(yǎng)基起始pH對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶有一定影響。隨著培養(yǎng)基起始pH的增大，中性蛋白酶酶活力呈先升高后降低的變化趨勢(shì)；pH 為6.0時(shí)，酶活力最高，達(dá)到（589.4±15.22） U/g。pH為7.0時(shí)，酶活力下降到（461.5±13.85） U/g。當(dāng)pH為9.0時(shí)，酶活力降低到最小值，為（315.9±11.76） U/g。

2.8 無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

由表4可知，無機(jī)鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶也有影響，Mg2+、K+、NH4+對(duì)產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+對(duì)產(chǎn)酶有明顯的抑制作用。當(dāng)無機(jī)鹽為0.02%（NH4）2SO4溶液時(shí)，中性蛋白酶酶活力最高，達(dá)到（859.6±16.34） U/g。

2.9 發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基中各組分的配比與培養(yǎng)條件。由表5可知，試驗(yàn)條件下優(yōu)化水平的最佳組合為A1B3C3D3，米曲霉GN-2產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件為培養(yǎng)基組分麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)溫度25 ℃、加水量20 mL、培養(yǎng)時(shí)間72 h。極差分析可知，各因子對(duì)酶活力影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間、加水量。方差分析（表6）表明，培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響顯著，而發(fā)酵培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)時(shí)間以及加水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響不顯著。按照最佳組合試驗(yàn)得到的酶活力為1 016.9 U/g。

3 結(jié)論與討論

單因素試驗(yàn)表明，固體發(fā)酵的適合產(chǎn)酶條件為麩皮∶黃豆粉為 4∶1，發(fā)酵時(shí)間 60 h，培養(yǎng)溫度25 ℃，培養(yǎng)基加水量10 mL，接種量2.0 mL孢子懸液，培養(yǎng)基起始pH 6.0，無機(jī)鹽0.02%（NH4）2SO4 1 mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度為25 ℃、加水量為20 mL、麩皮∶豆粉為4∶1、培養(yǎng)時(shí)間為72 h 的組合酶活力最高，達(dá)1 016.9 U/g。筆者在后續(xù)試驗(yàn)中采用該正交試驗(yàn)的優(yōu)化條件，進(jìn)行了3次發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果酶活力均值為（993.6±14.62） U/g。說明經(jīng)過優(yōu)化，酶活力得到了提高。

中性蛋白酶可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過微生物生產(chǎn)。由于動(dòng)植物資源受到各種條件的限制，不易擴(kuò)大生產(chǎn)。而微生物具有生長(zhǎng)快、種類多等優(yōu)點(diǎn)，且微生物易變異，通過菌種改良可以進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量，改善酶的生產(chǎn)和酶的性質(zhì)，因此目前工業(yè)酶制劑大部分都是通過微生物發(fā)酵進(jìn)行大規(guī)模制造的?？梢陨a(chǎn)蛋白酶的微生物有細(xì)菌、放線菌和真菌等。米曲霉可以生產(chǎn)多種酶，如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等，中性蛋白酶為其中的一種。米曲霉是一種常用的酶制劑生產(chǎn)菌種。本試驗(yàn)主要探討了多種因素對(duì)米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的影響，得到的試驗(yàn)結(jié)果與前人的研究結(jié)果[4，5]基本一致。但是若要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，需要根據(jù)具體情況選擇合適的條件。

在生產(chǎn)中，若能夠提高菌株的產(chǎn)酶能力，則可節(jié)約生產(chǎn)成本，獲得較大的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，有研究者通過理化因子誘變或者基因工程技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行改良處理，篩選得到一些產(chǎn)酶能力較高的菌株。由于誘變具有不定向性，因此這方面的研究有待進(jìn)一步深入。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳武勇，辜海兵，秦 濤，等.中性蛋白酶水解鉻革屑的研究[J].中國(guó)皮革，2001，30（21）：2-5.

[2] 李水泉，姚 恕.中性蛋白酶發(fā)酵工藝優(yōu)化研究[J].微生物學(xué)通報(bào)，1995，22（3）：154-155.

[3] 張 敏，趙 從，路福平，等.產(chǎn)中性蛋白酶菌株發(fā)酵條件的研究[J].食品研究與開發(fā)，2007（12）：44-48.

[4] 楊世平，邱德全.米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶的適宜條件[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2005（3）：47-51.

[5] 蘇 龍，陳顯玲，李家洲.米曲霉固體發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶產(chǎn)酶條件研究[J].玉林師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（5）：86-89.

[6] 吳繼星，陳在餌，張志剛.蘇云金桿菌WG-001工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（3）：91-94.

[7] 肖懷秋，林親錄，李玉珍，等.產(chǎn)中性蛋白酶B4發(fā)酵條件的研究[J].食品與生物技術(shù)，2004，20（5）：23-25.

[8] 天津輕工業(yè)學(xué)院，大連輕工業(yè)學(xué)院，無錫輕工業(yè)學(xué)院.工業(yè)發(fā)酵分析[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1986.