韓艷艷 馬世江 康麗霞 栗延偉 譚軍

摘要：

目的：觀察糖氧剝奪對星形膠質(zhì)細胞的影響及腺苷的保護作用。方法：取體外培養(yǎng)第三代或第四代星形膠質(zhì)細胞，傳代至96孔板或24孔板內(nèi)，細胞貼壁并長出突起后，隨機分為三組：正常對照組（normal control group）、糖氧剝奪組（OGD group）、腺苷預處理組（ADO group），進行糖氧剝奪/復氧處理。觀察糖氧剝奪8h復氧糖24h后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)、細胞活性。結果：糖氧剝奪復氧糖24h后，正常對照組星形膠質(zhì)細胞生長狀態(tài)良好；OGD模型組星形膠質(zhì)細胞胞體水腫變圓，細胞形態(tài)由不規(guī)則變成梭形，突起明顯變短或消失；ADO組細胞水腫較輕。OGD模型組星形膠質(zhì)細胞活力下降，OD值明顯低于正常對照組（P<0.01）；ADO組細胞活力顯著高于OGD模型組，表明ADO能明顯改善細胞活力（P<0.01）。結論：糖氧剝奪可引起星形膠質(zhì)細胞嚴重損傷，星形膠質(zhì)細胞形態(tài)、活性與缺氧缺糖呈對應變化，腺苷能減少糖氧剝奪后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學改變及細胞凋亡，提示腺苷對糖氧剝奪的星形膠質(zhì)細胞有一定的保護作用。

關鍵詞：腺苷；星形膠質(zhì)細胞；糖氧剝奪

The protection of Adenosine Preconditioning on Oxygen-glucose deprivation injury induced astrocyte cells

【Abstract】

Objective To investigate the effect of oxygen-glucose deprivation and protective effect of adenosine on astrocytes. MethodsAstrocytes were cultured for third or fourth generation in vitro， and then passaged at 96 or 24 well plate. When the astrocytes attaching to the wall and growing with prominences， they were randomly divided into 3 groups， normal control group， oxygen-glucose deprivation （OGD） group and adenosine preconditioning （ADO） group. The cells were taken OGD/reoxygenation treatment. The morphology and activity of astrocyte cells were observed at 8 hours after OGD and 24 hours after reoxygenation. Results At 24 hours after OGD/reoxygenation treatment， the astrocyte cells were with normal morphology in normal control group； the soma of astrocyte cells became edema and round in OGD group， the cell morphology changed to fusiformis from irregular， and prominence obviously became short or disappeared； the edema was lighter in ADO group. Activity of astrocyte cells decreased in OGD group， and OD value was significantly lower than that in normal control group （P<0.01）. Cell activity was higher in ADO group than that in OGD group， which indicated that ADO can obviously improved cell activity （P<0.01）. Conclusions Astrocytes are injured seriously after OGD； morphology and cell activity of astrocytes take change in accordance with oxygen deficit and glucose deprivation. Adenosine can decrease morphological changes and cell apoptosis of astrocyte cells after OGD. we can make conclusion that adenosine has influence on astrocytes after OGD.【Key words】Adenosine； Astrocyte； Oxygen-glucose deprivation

【中圖分類號】

Q2-09 【文獻標識碼】B 【文章編號】1002-3763（2014）05-0018-02

腦血管疾病是人類三大死亡原因之一，缺血性腦血管病是一類常見病、多發(fā)病，其致殘率與病死率都很高。缺血后的血流恢復在某些情況下能導致進一步的組織損傷和功能障礙， 這種恢復血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷（ischemia- reperfusion injury， IRI） ，這一概念在1970年經(jīng)實驗證實^[1]，抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關鍵環(huán)節(jié)。有研究表明，腺苷及其受體在多種臟器缺血再灌注損傷的保護方面有重要作用[2、3、4]

。星形膠質(zhì)細胞（Astrocyte，Ast）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細胞，過去Ast僅被視為具有固定神經(jīng)元的功能，對神經(jīng)元起支持和營養(yǎng)作用。而現(xiàn)在人們逐漸認識到它在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮著很關鍵的作用。本研究探討腺苷預處理對糖氧剝奪損傷Ast的保護作用，揭示腺苷對神經(jīng)系統(tǒng)的保護機制，為腺苷應用于臨床治療腦血管疾病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：出生24小時內(nèi)的Sprague-Dewley（SD）大鼠，雌雄不限，體重約10-12g。由新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)基、DMEM無糖培養(yǎng)基購于Gibico公司，胰蛋白酶粉、XTT、PMS購于Sigma公司，胎牛血清購于杭州四季青，兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP多克隆抗體購于中杉金橋公司，F(xiàn)ITC標記羊抗兔IgG購于博奧森公司，腺苷（Adension）購于Amresco公司；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱（德國Heraeu公司）、Eclipse E200顯微鏡（日本Nikon公司）、BIO-TEK ELX800 酶標儀（美國寶特儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 星型膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)： 參照俞愛青

^[5]的方法行體外SD大鼠星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)：取材后利用機械分離法和差速貼壁法純化培養(yǎng)Ast，接種密度為1×109L-1，根據(jù)細胞生長情況，2～3d半量換液1次。原代細胞培養(yǎng)至鋪滿瓶底約85%后，即可傳代，傳代細胞生長較快，一般5～7d即可再次傳代，取第3代、第4代細胞進行免疫細胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白酶（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光鑒定（根據(jù)說明書操作）及實驗。

1.3.2 實驗分組及處理過程：取第3代或第4代Ast，根據(jù)監(jiān)測指標要求將細胞傳代時將其傳至96孔或24孔板內(nèi)，分為實驗對照組（normal control group）、氧糖剝奪模型組（Oxygen glucose deprivation，OGD group）、腺苷預處理組（ADO group）。實驗正常對照組不進行氧糖剝奪，在氧糖剝奪期及復氧糖期均更換完全DMEM培養(yǎng)基。OGD組在氧糖剝奪期更換成無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基；ADO組在氧糖剝奪前24h給予含100μmol/L腺苷的完全DMEM培養(yǎng)基，氧糖剝奪時更換為無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基。

1.3.3 氧糖剝奪/復氨糖過程：OGD組和ADO組在氧糖剝奪期分別更換為預熱的無糖DMEM培養(yǎng)基，去培養(yǎng)板蓋，放入自制密閉的溫度保持在（37±0.5）℃的從入口持續(xù)充入缺氧混合氣體（含體積分數(shù)為95%N2，5%CO2），出口接入水密封瓶的3升缺氧倉中進行缺氧處理。缺氧氣體由缺氧倉頂部進入，由底部排出，初以10L/min，6min后缺氧倉內(nèi)O2濃度降至1%，再以1L/min持續(xù)充入缺氧混合氣體，并開始計時缺氧8h。8h后取出培養(yǎng)板，OGD組及ADO組均更換為預熱的復糖DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)實驗設計檢測以下試驗指標。

1.3.4 檢測指標：觀察氧糖剝奪8h復氧糖24h后各組Ast形態(tài)學變化、檢測細胞活性變化。

1.3.4.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化

1.3.4.2 細胞活性檢測：將對數(shù)生長期的星形膠質(zhì)細胞以5×104個細胞/mL的密度接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞基本融合后，吸棄培養(yǎng)液，進行隨機分組，每組設3個復孔，重復3次，各組氧糖剝奪處理過程如同上述，各孔加入相應的培養(yǎng)基100uL，在再復氧復糖22h時，每孔加入預溫37℃的XTT復合溶液50μL。在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2小時，用450nm波長測定OD值，然后將光密度值（OD值）按以下公式計算：

細胞存活率=（樣本吸光度-空白組的吸光度）/對照組的吸光度×100%

1.4 統(tǒng)計學方法分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（X±S）表示，采用Prism4.0軟件包進行統(tǒng)計學分析，多組之間顯著性檢驗用單因素方差分析， P<0.05為差異有顯著性。

2 實驗結果

2.1 倒置顯微鏡下觀察OGD后Ast形態(tài)差異。

糖氧剝奪后，OGD組和ADO組形態(tài)上無明顯差異，均顯示星形膠質(zhì)細胞突觸縮短，倒置顯微鏡下觀察細胞透亮度增加，明顯可見細胞突觸之間的廣泛聯(lián)系，網(wǎng)狀交織較糖氧剝奪前明顯。復糖氧24h后可見OGD組細胞形狀各異、細胞水腫，胞膜不完整；ADO組水腫相對較輕，細胞排列相對整齊。

2.2 XTT比色法檢測細胞活性（對照組、OGD組、ADO組）： 通過對XTT比色法的OD值進行單因素方差分析制得表1和圖表1。由表1可知，OGD模型組星形膠質(zhì)細胞活力下降，OD值明顯低于正常對照組（P﹤0.01），表明細胞因受損傷或死亡而導致細胞活力明顯下降。ADO組細胞活力顯著高于OGD模型組，表明ADO能明顯改善細胞活力（P﹤0.01）。

3 討論

腺苷用于缺血再灌注損傷已有很長時間，但更多的是用于心肌的缺血再灌注損傷^[6]

。短暫缺血后心肌不僅具有即刻保護作用，同時在24～72h 內(nèi)會出現(xiàn)延遲保護作用^[7]。腺苷（adenosine， ADO）及其受體參與了心肌缺血預處理的早期保護作用，同時也是延遲保護的重要介質(zhì)[8、9]。

表1 氧糖剝奪各組XXT法細胞活性比較（X±S）

目前已知的腺苷受體（adenosine receptor， AR）有4種亞型，即A1受體（A1R）、A2a受體（A2aR）、A2b受體（A2bR）和A3受體（A3R）。 缺血預處理時用藥物阻斷A1受體或ATP通道能阻斷缺血耐受的形成。大量的體內(nèi)外研究表明，AlR在腦缺血中具有神經(jīng)保護作用原代培養(yǎng)的皮質(zhì)或海馬神經(jīng)元細胞，在糖-氧剝奪的條件下給予A1R選擇性激動劑環(huán)己基處理后，其細胞損傷明顯減輕，而A1R特異性拮抗劑可加重同一缺氧模型所誘導的細胞損傷。同樣，在腦缺血的動物模型中也有類似發(fā)現(xiàn)。這些都提示AlR對腦缺血具有神經(jīng)保護作用^[10]。

內(nèi)源性腺苷釋放誘導IPC樣保護作用，保護作用分為早期和延遲兩個時相，早期保護在預處理數(shù)分鐘后出現(xiàn)，持續(xù)幾個小時，可能主要涉及內(nèi)源性活性物質(zhì)；延遲保護在預處理后24小時出現(xiàn)，持續(xù)數(shù)天，與早期保護不同，與諸多基因表達的增強或受抑有關，包括熱休克蛋白（heat derived neurotrophic factor HSP）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor BDNF）細胞因子、抗氧化酶等^[11].

經(jīng)相關實驗證明，測定急性反復缺血、缺氧小鼠的腦組織內(nèi)腺苷含量，急性缺血、缺氧1次的小鼠，腦組織內(nèi)的腺苷含量高于對照組（ P < 0、05） ，而反復急性缺血、缺氧組小鼠腦組織內(nèi)的腺苷含量又高于1次急性缺血、缺氧組^[12]，證明了腦組織缺血、缺氧，特別是反復缺血、缺氧的刺激，引起動物體內(nèi)腺苷含量的升高。吳浩等人經(jīng)過實驗得出結論：反復發(fā)作的短暫性腦缺血發(fā)作（TIA）會刺激體內(nèi)腺苷水平升高，并有一定的腦保護作用，增強機體對缺血、缺氧的耐受，可能會改善卒中的癥狀和預后^[13]。缺糖缺氧可引起海馬神經(jīng)元嚴重損傷，神經(jīng)元損傷程度與神經(jīng)元存活率、LDH 滲出含量的改變呈對應變化。腺苷能減少缺糖缺氧后神經(jīng)元的損傷，減少缺糖缺氧后神經(jīng)元凋亡，提示腺苷對缺糖缺氧海馬神經(jīng)元具有一定的保護作用^[14]。因此，從理論上講：通過預先給予星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入腺苷，隨著體外模擬腦缺血模型的建立，激發(fā)腺苷受體的表達，誘導星形膠質(zhì)細胞缺血缺氧耐受形成。

該實驗組已經(jīng)過相關實驗證實，Ast對神經(jīng)元的保護作用^[15]。本實驗結果提示，無論從形態(tài)學變化，還是Ast活性變化，氧糖剝奪對體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞可造成嚴重的損傷，隨著復氧時間的延長，星形膠質(zhì)細胞的損傷逐漸加重。ADO可減輕氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細胞的損傷，具有一定保護作用。

因此本實驗觀察到的腺苷能減少缺糖缺氧后星形膠質(zhì)細胞的損傷，減少缺糖缺氧后再恢復糖和氧供應后的星形膠質(zhì)細胞的凋亡，提示腺苷對體外培養(yǎng)的缺糖缺氧星形膠質(zhì)細胞具有一定保護作用。實驗結果支持上述腺苷通過減輕Ca²⁺超載、氧自由基損傷等引發(fā)的星形膠質(zhì)細胞水腫、細胞膜損傷、線粒體損傷及DNA損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用的。其具體機制有待進一步研究。

參考文獻

[1]Harrison RG. Observations on the living developing nerve fiber [J]， Anat Rec， 1970，1（6）：116-120.

[2] Di Paola R， Melani A， Esposito E， et al. Adenosine A2a Receptor Selective Stimulation Reduces Signaling Pathways Involved in the Development of Intestine Ischemia and Reperfusion Injury[J]. Shock，2010，33（5）：541-551.

[3] Park SW， Chen SWC， Kim M， et al. Selective intrarenal human A1 adenosine receptor overexpression reduces acute liver and kidney injury after hepatic ischemia reperfusion in mice[J]. Laboratory Investigation，2010，90（3）：476-495.

[4] Taha MO， Miranda-Ferreira R， Sim？es RS， et al. Role of Adenosine on Intestinal Ischemia- Reperfusion Injury in Rabbits[J]. Transplantation Proceedings，2010，42（2）：454-456.

[5] 俞愛青，崔紅梅，周志俊.新生鼠星形膠質(zhì)細胞分離培養(yǎng)方法[J].毒理學雜志.2009，23（1）：70-72.

[6] 周必強， 葉世鐸.腺苷預處理和缺血預處理心肌保護效果對比研究[J].實用心腦肺血管病雜志.2006，14（12）：950-952.

[7] Ravingerová T. Intrinsic defensive mechanisms in the heart ： a potential novel approach to cardiac protection against ischemic injury1 GenPhysiol Biophys ， 2007 ， 26（1） ： 31-40.

[8] Salloum FN ， Das A ， Thomas CS ， et al1 Adenosine A （1） receptor mediates delayed cardi- oprotective effect of sildenafil in mouse[J]. J MolCell Cardiol， 2007，43 （5）： 545.

[9] 楊簡， 楊俊， 丁家望， 等，腺苷后適應對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響[J].解放軍醫(yī)學雜志. 2008，33 （2）： 136.

[10] Stone T W.Adenosine，neurodegeneration and ettroprotection[J].Nearol Res，2005，27（2）：161.168.

[11] Siesjo B， Katsura KI， Zhao Q， et al. Mechanisms of secondary brain damage in global and focal ischemia： a speculative synthesis [J].J Neurotrauma，1995，12（5）：943-956.

[12] 張偉麗， 呂國蔚. 急性重復缺氧對小鼠腦組織腺苷及其A1受體的影響[J]. 中國應用生理雜志. 1997， 13：114-117.

[13] 吳浩、甘解華等.腦缺血患者血清中腺苷水平的變化[J].中國腦血管病雜志.2008，5：184-185.

[14] 丁愛石，吳 燕， 吳麗穎等.腺苷對體外培養(yǎng)的海馬缺糖缺氧神經(jīng)元的保護作用[J].中國病理生理雜志.2003，19（8）：1079–1083.

[15] 尉娜，譚軍.腺苷預處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師，2011， 13（6）：7-8.