沈東旭

摘要：

目的：尋找一種快速測(cè)定牛奶中尿素含量的分析方法。方法：樣品中加入三氯乙酸溶液，高速離心后取5 mL清液，過(guò)0.22 μm水相濾膜（聚醚砜）后通過(guò)AA3流動(dòng)注射分析儀在線測(cè)定尿素含量。結(jié)果：尿素濃度在0 - 300 mg/kg范圍內(nèi)，可獲得良好線性，相關(guān)系數(shù)r為0.9996，檢出限為5.3 mg/kg，在添加水平50和100 mg/kg條件下，回收率范圍98.2 - 101 %，日內(nèi)和日間精密度范圍2.7 - 3.6 %。結(jié)論：該方法具有較高的穩(wěn)定性，耐用性，精密度和準(zhǔn)確度，操作簡(jiǎn)單，適用于牛奶中尿素含量的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞：流動(dòng)注射；尿素；牛奶

【中圖分類(lèi)號(hào)】

TU266+.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1002-3763（2014）05-0234-02

尿素是乳液的常規(guī)組分并構(gòu)成非蛋白氮的一部分^[1]。一般情況下，牛奶中尿素的正常含量范圍為200 - 300 mg/kg。但是，個(gè)別不法商販通過(guò)在鮮奶中人為添加尿素來(lái)提高總氮含量，這不僅影響了牛奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更重要的是給消費(fèi)者身體健康造成危害^[2]。因此，建立一種牛奶中尿素含量的快速檢測(cè)方法以加強(qiáng)對(duì)牛奶品質(zhì)監(jiān)管具有重要意義。

流動(dòng)注射分析法，實(shí)現(xiàn)了尿素和試劑的在線混合反應(yīng)，并將樣品的分析和結(jié)果報(bào)告全部自動(dòng)化，避免了人工操作的不穩(wěn)定性，簡(jiǎn)化了操作程序。趙立晶^[3]等首次采用流動(dòng)注射法測(cè)定奶制品中的尿素，使用在線透析去除脂肪等影響，方法簡(jiǎn)便，但是在線透析裝置價(jià)格昂貴，且濾膜需要經(jīng)常更換。本實(shí)驗(yàn)中我們采用新型的氣泡隔斷式流動(dòng)分析儀，信號(hào)更加穩(wěn)定，靈敏度更高，并通過(guò)降低樣品量，很好消除了脂肪對(duì)檢測(cè)的影響，取得了良好的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑：

AutoAnalyzer 3（AA3）流動(dòng)注射分析儀（德國(guó)SEAL公司）：尿素分析模塊，520nm濾片；Millipore 超純水設(shè)備（美國(guó)Millipore公司），分析天平BT224S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），ST16R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司），渦旋混合器Lab Dancer S25（德國(guó)IKA公司）

尿素（H2NCONH2），三氯乙酸（CCl3COOH），氨基硫脲（CH5N3S），二乙酰一肟（C4H7NO2），磷酸（H3PO4），硫酸（H2SO4），三氯甲烷（CHCl3）均為分析純或者優(yōu)級(jí)純?cè)?。?shí)驗(yàn)用水為Millipore純水。

酸溶液：300 mL磷酸中加入10 mL濃硫酸，用純水稀釋至500 mL；可長(zhǎng)期放置。

二乙酰一肟溶液：將5 g二乙酰一肟溶解在200 mL純水中?？梢员４鎯芍堋?/p>

氨基硫酸溶液：將0.25 g氨基硫脲溶解在100 mL純水中。可以保存兩周。

尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1000 g尿素于小燒杯中，加少量純水溶解后轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶中，加0.1 mL三氯甲烷并用純水定容，此溶液每毫升含0.1 mg尿素。冷藏保存。移取適量尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用15 %三氯乙酸溶液稀釋定容，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2 樣品前處理： 稱(chēng)取2.5 g樣品于50 mL離心管中，加入22.5 mL 15 %三氯乙酸溶液，渦旋混合30 s。接著以7500 r/min，10 ℃高速離心5 min，然后用針筒吸取約5 mL清液，過(guò)0.22 μm水相濾膜（聚醚砜）后進(jìn)行分析。

1.3 儀器參數(shù)： 測(cè)量波長(zhǎng)為520 nm； 分析速率為40 個(gè)樣/h； 取樣時(shí)間60 s，沖洗時(shí)間30 s，在線加熱溫度為95 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件研究： 本實(shí)驗(yàn)中考察了環(huán)己烷除脂對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。同一份牛奶樣品采用2種前處理方法。A方法同1.2，B方法比A方法多了一步，在離心后濾液中加入10mL正己烷，取下層液體5mL進(jìn)行測(cè)定。配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果如表1所示，，查表得t（0.05，9）=2.26，tD

2.2 方法確證：

根據(jù)歐盟2002/657/EC^[4]的授權(quán)文件，確定方法的穩(wěn)定性、耐用性、線性范圍、檢出限、回收率以及精密度等。

2.2.1 穩(wěn)定性：

通過(guò)調(diào)節(jié)樣品的冷藏時(shí)間和分析時(shí)間，4℃下保存0，1，7，14，21天；將稱(chēng)量后的牛奶放在空氣中0，5，10，30，60 min后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著差異，尿素在本實(shí)驗(yàn)條件下十分穩(wěn)定，所以實(shí)驗(yàn)周期可以很長(zhǎng)。

表1 2種方法測(cè)定尿素含量的數(shù)據(jù)對(duì)比

2.2.2 耐用性：

實(shí)驗(yàn)中考察了最重要的因素三氯乙酸濃度對(duì)結(jié)果的影響，分別使用10%，12%，15%，20%，25%三氯乙酸提取同一份牛奶中的尿素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，尿素的回收率在92.5-102%之間，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)顯著性影響。說(shuō)明此方法允許三氯乙酸濃度在較寬的范圍內(nèi)變化，增加了方法的可操作性。

2.2.3 線性范圍和檢出限：

配制系列質(zhì)量濃度（0、10、50、100、150、200、300 mg/kg）的尿素進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰高為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。尿素濃度在0 - 300 mg/kg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=0.1915x+0.3169，r=0.9996（x是尿素濃度，mg/kg；Y是峰高百分比，%）

根據(jù)EPA關(guān)于方法檢出限的定義，對(duì)20 mg/kg的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液平行前處理8份，測(cè)定峰高，并換算到尿素濃度并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S。檢出限：DL=S * t（n-1，0.99）（S是平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差；t（n-1，0.99）是置信區(qū)間99 %，自由度為n-1時(shí)的t值，當(dāng)n=8， t（7，0.99）=2.998）。根據(jù)計(jì)算，檢出限為5.3 mg/kg。

2.2.4 精密度和回收率： 在同一份牛奶樣品中，添加尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平為50， 100 mg/kg，測(cè)定3天，每天重復(fù)6次，回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法的精密度和準(zhǔn)確度

2.3 實(shí)際樣品分析：

對(duì)市場(chǎng)上常見(jiàn)的10種牛奶樣品中的尿素進(jìn)行檢測(cè)，如表1，結(jié)果顯示，尿素含量范圍為187.8 - 281.1 mg/kg。

3 結(jié)論

本文介紹了一種用于牛奶中尿素含量的大批量快速測(cè)定方法。采用三氯乙酸溶液作為提取試劑，提取液直接通過(guò)AA3流動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)。操作簡(jiǎn)單，消耗溶劑少，每小時(shí)可以分析40個(gè)樣品，為鑒別牛奶中是否摻加尿素提供了一種有效的測(cè)定方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙旭博， 董文賓， 王順民等. 國(guó)外牛奶中尿素含量檢測(cè)新進(jìn)展[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2004， 25 （6）： 109 - 114

[2] 翟永信編. 食品摻偽監(jiān)測(cè)方法[M]. 北京： 北京大學(xué)， 1992

[3] 趙立晶， 閆杰， 馬東升等. 在線透析-流動(dòng)注射光度法測(cè)定奶及奶制品中尿素含量[J]. 分析化學(xué)， 2011， 39（2）： 183-187

[4] 2002/657/EC， Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun. 2002， L221， 8 - 36.