董 雷蔡宛如朱詩乒

1浙江省新華醫(yī)院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫(yī)院呼吸科

·論 著·

芍藥甘草湯對哮喘大鼠STAT 6與IL-13水平的影響

董 雷1蔡宛如1朱詩乒2

1浙江省新華醫(yī)院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中醫(yī)院呼吸科

目的觀察芍藥甘草湯對哮喘大鼠信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT 6）與白介素-13（IL-13）水平的干預(yù)作用，探討其防治支氣管哮喘的作用機(jī)制。方法60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NULL組）、模型組（OVA組）、地塞米松組（DXM組）及芍藥甘草湯高（SG10組）、中（SG5組）、低（SG2.5組）劑量組，每組10只。除正常對照組外均行支氣管哮喘造模，相應(yīng)藥物灌胃。檢測各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，免疫組化法測肺組織中STAT 6蛋白表達(dá)，ELISA法檢測血漿中IL-13含量。結(jié)果與NULL組比較，OVA組哮喘大鼠肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及氣道上皮STAT 6表達(dá)和血漿IL-13水平均明顯升高（P＜0.01）。DXM組及各劑量芍藥甘草湯組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、氣道上皮STAT 6表達(dá)和血漿IL-13水平較OVA組降低（P＜0.01），但仍高于NULL組（P＜0.01）。結(jié)論芍藥甘草湯防治大鼠支氣管哮喘的作用機(jī)制可能與抑制哮喘大鼠肺組織STAT 6表達(dá)，降低血漿IL-13水平，降低哮喘大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)。

大鼠；哮喘；芍藥甘草湯；信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6；白介素-13

支氣管哮喘是一種由多種因素引起的以可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的免疫變態(tài)反應(yīng)性疾病。芍藥甘草湯系張仲景《傷寒論》中的著名方劑，主要由芍藥和甘草二味中藥等量組成，藥理研究證實(shí)，芍藥甘草湯具有明顯的解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[1]。近十幾年來，單用此方或隨癥加減治療哮喘、頑咳和小兒百日咳療效十分顯著[2]。本研究旨在探討芍藥甘草湯治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：2011A032。

1.2試劑與藥物 卵白蛋白（Sigma公司）；氫氧化鋁干粉（廣州化學(xué)試劑廠，批號961201-2）；地塞米松片（浙江仙居制藥股份有限公司）；IL-13 ELISA試劑盒（ADL公司，批號070633）；免疫大鼠STAT6多克隆抗體（晶美公司）；芍藥甘草湯（芍藥、甘草等分組成，藥材由浙江省中醫(yī)院中藥房提供，濃煎成每毫升含1g生藥）；

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 M304020壓縮霧化機(jī)（德國百瑞公司），OLYMPUS BX50顯微攝像系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

1.4動物分組及模型建立 60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NULL組）、模型組（OVA組）、地塞米松組（DXM組）、芍藥甘草湯高劑量組（SG10組）、芍藥甘草湯中劑量組（SG5組）、芍藥甘草湯低劑量組（SG2.5組），每組10只。除正常對照組之外，其余各組均進(jìn)行支氣管哮喘造模[3]。造模方法：第1、7、14天分別給予雞卵白蛋白（OVA）抗原液1mL（含OVA 10mg，氫氧化鋁凝膠20mg，滅活百日咳桿菌5×109個(gè)）腹腔注射，1天1次，第21天開始給予1%OVA溶液霧化吸入，1天1次，每次30min，連續(xù)3天。以大鼠出現(xiàn)呼吸急促，點(diǎn)頭呼吸，甚則四肢末端紫紺為造模成功的標(biāo)志。正常對照組：第1、7、14天分別給予生理鹽水1mL腹腔注射，第21天開始給予生理鹽水超聲霧化吸入，1天1次，每次30min，連續(xù)3天。

1.5給藥方法 每次霧化前30min，NULL組、OVA組予生理鹽水10mL/kg體質(zhì)量灌胃；DXM組予DXM 1mg/kg灌胃；SG10組、SG5組、SG2.5組予芍藥甘草湯10g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃。

1.6標(biāo)本采集和處理 各組均于首次霧化后5d采集和處理標(biāo)本。每組大鼠均予3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取血制備血漿，右肺肺泡灌洗，左肺留取病理。

1.7檢測指標(biāo)及方法

1.7.1支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)測定 取血完畢后大鼠行氣管插管至右肺并結(jié)扎，用4℃生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，每次3mL，反復(fù)灌洗3次，回收率均大于50%，取0.1mLBALF在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算白細(xì)胞總數(shù)，然后將BALF離心10min（1000rpm），離心沉淀后細(xì)胞團(tuán)重懸于1mLPBS（磷酸鹽緩沖溶液）中，取0.2mL圖片，瑞吉染液染色，至少計(jì)數(shù)400個(gè)細(xì)胞做細(xì)胞分類，再計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目。

1.7.2血漿IL-13測定 各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，剖腹，分離腹主動脈取血，37℃水浴15min，3000r/min離心20min，取上部血清，保存于-20℃冰箱中。用ELISA法測定血清IL-13。

1.7.3氣道上皮STAT 6蛋白檢測 肺組織切片后用免疫組化法進(jìn)行測定。光學(xué)顯微鏡下觀察5個(gè)完整的氣道橫切面免疫組化圖像，氣道上皮細(xì)胞STAT 6陽性表達(dá)表現(xiàn)為胞漿和/或胞核黃色染色，對圖像進(jìn)行攝影，利用圖像分析儀對圖像進(jìn)行分析，計(jì)算STAT 6蛋白的陽性表達(dá)單位（PU，positive unit）。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 OVA組BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較NULL組明顯升高（P＜0.01）；DXM組和各劑量芍藥甘草湯組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較OVA組減少（P＜0.01），但高于NULL組（P＜0.01）；SG2.5組白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于DXM組和其他劑量SG組（P＜0.05）；DXM組與SG10、SG5組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2各組血漿IL-13含量比較 OVA組血漿IL-13含量較NULL組升高（P＜0.01）；DXM組和各劑量芍藥甘草湯組血漿IL-13較OVA組減少（P＜0.01）；DXM組IL-13含量低于不同劑量SG組（P＜0.05）；SG10、SG5、SG2.5組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（） ×107/L

表1 各組大鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（） ×107/L

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與SG2.5組比較，△P＜0.05

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表2 各組大鼠血漿IL-13比較（）pg/mL

表2 各組大鼠血漿IL-13比較（）pg/mL

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與DXM組比較，☆P＜0.05

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2.3 各組大鼠氣道上皮STAT 6蛋白表達(dá) OVA組氣道上皮STAT 6陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯高于NULL組（P＜0.01）；DXM組和不同劑量SG組陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯低于OVA組（P＜0.01）；DXM組和SG10、SG5組STAT6的陽性細(xì)胞表達(dá)量低于SG2.5組（P＜0.05）；DXM組與SG10、SG5組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達(dá)（）pg/mL

表3 各組大鼠氣道上皮STAT6蛋白表達(dá)（）pg/mL

注：與NULL組比較，*P＜0.01；與OVA組比較，▲P＜0.01；與SG2.5組比較，△P＜0.05

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3 討論

支氣管哮喘是一種氣道慢性變應(yīng)性炎癥性疾病,多種炎性細(xì)胞參與哮喘發(fā)病過程，目前認(rèn)為嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘氣道炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，大多數(shù)炎性細(xì)胞最終通過EOS產(chǎn)生效應(yīng)[4]。IL-13是一種主要由活化的Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子，可刺激細(xì)胞的增殖和合成，通過與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的作用而誘發(fā)哮喘的急性發(fā)作。近年研究表明，IL-13可不依賴于IL-4、IgE及嗜酸粒細(xì)胞等傳統(tǒng)途徑而誘發(fā)哮喘的所有癥狀，因此，IL-13被認(rèn)為是哮喘發(fā)病中極為重要的一種介質(zhì)[5]。STAT 6是一種能被眾多細(xì)胞外多肽類分子激活、參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，它通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)細(xì)胞因子IL-4、IL-13等的生物學(xué)活性。Akimoto等[6]研究發(fā)現(xiàn)，STAT 6基因缺陷小鼠（STAT 6-/-）吸入卵蛋白致敏后，肺泡灌洗液中未發(fā)現(xiàn)EOS浸潤，肺組織、支氣管黏膜、支氣管周圍組織未見炎癥反應(yīng)，氣道反應(yīng)性試驗(yàn)未見氣道反應(yīng)性增高。研究表明，STAT 6通過調(diào)節(jié)Th2優(yōu)勢應(yīng)答促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖與分化、參與IgE的同種型轉(zhuǎn)換，在支氣管哮喘病理生理過程中起重要作用。

研究表明，芍藥的主要成分芍藥總苷是一種雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)藥，而甘草的主要成分甘草次酸有明顯的皮質(zhì)激素樣作用。Takagi[7]實(shí)驗(yàn)表明，甘草次酸抑制炎癥反應(yīng)的效價(jià)為氫化可的松的1/10。熊谷朗報(bào)道，甘草次酸能抑制IgE和組胺的合成從而發(fā)揮抗炎、抗過敏作用，而且芍藥總苷和甘草次酸具有協(xié)同作用[8]。

本研究表明，芍藥甘草湯可明顯抑制哮喘大鼠的氣道黏膜炎癥和EOS浸潤，同時(shí)降低IL-13水平和氣道上皮STAT6表達(dá)，說明芍藥甘草湯治療哮喘的作用可能通過上述機(jī)制實(shí)現(xiàn)。

［1］曹艷，旺建偉，段淑香，等.芍藥甘草湯臨床及藥理研究近況［J］.中醫(yī)藥信息，2006，23（3）：41-43.

［2］鄭繼生，錢景莉.芍藥甘草湯及其臨床運(yùn)用［J］.河南中醫(yī)，2012，32（8）：966-968.

［3］王洋，關(guān)煒，李韶妮.芍藥甘草湯防治支氣管哮喘機(jī)理研究［J］.山西中醫(yī)，2011，27（9）：43-45.

［4］Lampinen M，Hakansson L，Venge P.Interleukin-2 inhibit eosinophil migration but is counteracted by IL-5 priming［1］.Clin Exp Allergy，2001，31（2）：249-258.

［5］Wills-Karp M，Luyimbazi J，Xu X，et al.Interleukin-13：central mediator of allergic asthma［J］.Science，1998，282（3597）：2258-2261.

［6］Akimoto T，Numata F，Tamura M，et al.Abrogation of bronchia Eosinophilic inflammation and airway hyperreactivity in signal transducers and activators of transcription（STAT）b-deficient mice［J］.J Exp Med，1998，187（9）：1537-1542.

［7］Takagi.Study of Glycyrrhiza uralensis［J］.International journal of Oriental Medicine 1989，14（4）：185.

［8］中國醫(yī)科院藥物研究所等.中藥志［M］.北京：人民衛(wèi)生出社，1993：183-184.

Effects of Shaoyaogancaotang on STAT6 and Interleukin-13 in Asthmatic Rats

Dong Lei1，CAI Wanru1，ZHU Shiping2. 1 Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310005),China；2 Department of Respiratory Diseases，Hangzhou Chinese Medical Hospital.

ObjectiveTo observe the effect of Shaoyaogancaotang（SG）on signal transducer and activator of transcription 6（STAT6）and interleukin-13 in asthmatic rat,and to explore the possible mechanism of SG to asthma.MethodsSixty SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group（group NULL）,asthmatic group（group OVA）,dexamethasone group（group DXM）,group SG10,group SG5,and group SG2.5.Before nebulization,group NULL and OVA was given saline of 10ml/kg intragastrically,group DXM was given DXM of 1 mg/kg,and groups SG were given SG of 10,5,and 2.5 g/kg,respectively.The numbers of total leukocytes and eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were measured by light microscope.The protein expression of STAT6 in airway epithelium was shown by immunohistochemistry.The serum IL-13 were detected by ELISA.ResultsAfter sensitized and challenged,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF of OVA-treated rats significantly in creased compared with group NULL（P＜0.01）.After treatment with different dosages of SG and dexamethasone,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF,the STAT6 protein expression,and serum IL-13 were significantly lower than those in group OVA（P＜0.01）,but higher than those in group NULL（P＜0.01）.ConclusionShaoyaogancaotang can significantly inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,decrease the IL-SG can inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,and decrease the serum IL-13 and the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF.SG might be of potential value in protection and treatment of asthma.

asthma；Shaoyaogancaotang；signal transducer and activator of transcription 6；interleukin-13

2013-09-20

浙江省中醫(yī)藥優(yōu)秀青年人才基金計(jì)劃（No.2012ZQ013）