王貽蓮　郭凱　陳凱　李紀(jì)順　楊合同

摘要：研究越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418產(chǎn)生的殺線蟲活性代謝產(chǎn)物，采用根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）2齡幼蟲生物測定法對B418發(fā)酵液上清液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，B418代謝產(chǎn)物的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃；pH穩(wěn)定范圍為7.0～10.0，其中pH為7.0時(shí)B418代謝產(chǎn)物活性最高，B418代謝產(chǎn)物處理后8 h試蟲最高校正致死率為76.63%；以乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇均降低了B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性，氯仿不影響代謝產(chǎn)物活性，氯仿處理后的代謝產(chǎn)物線蟲死亡率穩(wěn)定在74%以上。

關(guān)鍵詞：越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418；代謝產(chǎn)物；殺線蟲活性；穩(wěn)定性

中圖分類號：TQ453.5；S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）05-1066-03

植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物，其危害超過細(xì)菌和病毒，僅次于致病真菌 [1，2]。據(jù)估計(jì)，全球每年由植物寄生線蟲造成的損失達(dá)1 250億美元[2]，這一損失的70%是由根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）引起[3]。根結(jié)線蟲寄主范圍廣，可危害多種常見蔬菜，且以種植面積較大的番茄、黃瓜、芹菜等受害較重，已成為蔬菜生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題之一[4]。

保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲的治理非常困難，在實(shí)際生產(chǎn)中，傳統(tǒng)的耕作措施，如輪作、種植抗病品種、施用農(nóng)家肥、日曬等往往難以奏效。長期大量施用化學(xué)殺線蟲劑防治根結(jié)線蟲，會導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染，破壞生態(tài)平衡[5]。生物防治因具有除害增產(chǎn)、保護(hù)生態(tài)平衡、減輕環(huán)境污染等優(yōu)勢[6]，越來越受到人們的關(guān)注。

多功能生防菌越南伯克霍爾德氏菌（Burkholderia vietnamiensis）B418由山東省科學(xué)院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存，該菌分離自白俄羅斯大麥根際土壤，能夠有效防治根結(jié)線蟲病。田間試驗(yàn)表明[7，8]，B418對番茄根結(jié)線蟲病的防治效果為63.42%，對茄子根結(jié)線蟲的防治效果為75.60%。室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示， B418發(fā)酵液上清液處理2齡根結(jié)線蟲6 h后校正死亡率達(dá)70%以上，可見，B418代謝產(chǎn)物含有殺線蟲活性物質(zhì)。本研究對越南伯克霍爾德氏菌B418發(fā)酵液上清液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測，旨在為其殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

越南伯克霍爾德氏菌B418、南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incongnita），由山東省科學(xué)院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存；乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和鹽酸均為市售分析純。

B418 固體培養(yǎng)基每升含 K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.02 g、CaCl2 0.2 g、NaMoO4·2H2O 0.002 g、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.066 g、谷氨酸鈉0.05 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g，pH 7.2～7.4；B418 液體培養(yǎng)基每升含蛋白胨10 g、酵母浸出物1 g、CaCl2 0.2 g，pH 7.2～7.4。

1.2 方法

1.2.1 生物測定方法

1）根結(jié)線蟲2齡幼蟲的獲得。根結(jié)線蟲用室內(nèi)盆栽番茄（中蔬4號）保存。當(dāng)番茄根系有大量卵囊出現(xiàn)時(shí)，取出根系，用自來水輕輕沖洗，小心取下卵囊，0.5% 次氯酸鈉中浸泡3 min，無菌水沖洗3次，放在盛有少量無菌水的培養(yǎng)皿里，25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，每隔24 h收集1次2齡幼蟲。

2）B418發(fā)酵上清液活性測定。B418發(fā)酵上清液（原液）加入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.1 mL，5次重復(fù)，并設(shè)無菌水作對照（CK）。分別向各孔中加入根結(jié)線蟲2齡幼蟲，每孔50條左右。放入25 ℃培養(yǎng)箱中，觀察記錄線蟲死亡情況，計(jì)算（校正）死亡率。

1.2.2 B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性測定

1）不同溫度及酸堿度下的穩(wěn)定性。取B418發(fā)酵上清液5倍稀釋后分別在常溫、60、80、100 ℃ 水浴鍋中處理60 min，-20 ℃處理12 h，115 ℃ 處理30 min，測定處理后的B418發(fā)酵上清液的殺線蟲活性，以6 h校正死亡率來體現(xiàn)。用1 mol /L NaOH 和1 mol /L HCl 將pH 分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5. 0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，靜置12 h 后將pH 調(diào)到7. 0，取原液和處理后的發(fā)酵上清液分別5倍稀釋后測定殺線蟲活性，以8 h校正死亡率來體現(xiàn)。

2）不同有機(jī)溶劑下的穩(wěn)定性。取B418發(fā)酵上清液，分別加入等體積乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿和乙酸乙酯，原液混合搖勻靜置12 h，如分層則將上下層各取400 μL、不分層的取800 μL，另取原液400 μL滴加到濾紙片上，60 ℃ 烘干，加入與滴加量等體積的無菌水浸泡濾紙片2 h，取浸泡液和原液測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 B418代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性測定

B418代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果見表1。由表1可知， 經(jīng)60 、80、100、115 ℃熱處理后，B418發(fā)酵上清液的殺線蟲活性隨處理溫度的升高而下降。表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。

2.2 B418代謝產(chǎn)物的酸堿穩(wěn)定性

B418代謝產(chǎn)物酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果見表2。由表2可知，B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0～10.0。其中，pH為7.0時(shí)活性最強(qiáng)，線蟲校正死亡率最高為76.63%。表明B418殺線蟲活性產(chǎn)物能耐pH 10.0以下的堿性環(huán)境。

2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知，B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，除氯仿和乙醚處理外，殺線蟲活性均有較大程度降低，其中乙酸乙酯處理活性降低最多，其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

3 小結(jié)與討論

越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株，具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí)，其定殖受環(huán)境（如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系）的影響[9，10]，制約著B418菌株的使用效果。因此，本試驗(yàn)對越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)，為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

通過對B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定，表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0～10.0，pH為7.0時(shí)活性最高，8 h最高校正死亡率為76.63%。另外，在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn)，初始pH為7.4時(shí)，接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降，但在7.0以上；6 h后pH持續(xù)上升，6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知，在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí)，可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用；乙醚處理殺線蟲活性雖然最高，因其有易揮發(fā)特性，可能存在溶劑相減少，樣品濃縮的可能，故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

[1] 韓生成，劉清利，孟頌東，等.植物寄生線蟲分子生物學(xué)和抗線蟲基因工程策略的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7（4）：395-400.

[2] 陳儒鋼.番茄和辣椒抗根結(jié)線蟲基因的克隆與鑒定[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[3] 莫明和，牟貴平.利用食線蟲真菌防治植物寄生線蟲的研究進(jìn)

展[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009， 18（12）：71-76.

[4] 趙 磊，段玉璽，白春明，等.遼寧省保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲發(fā)生規(guī)律及防治對策[J].植物保護(hù)， 2011，37（1）：105-109.

[5] 時(shí)立波，王振華，劉 靜，等.幾種殺線劑對土壤微生物數(shù)量及真菌多樣性影響[J].農(nóng)藥，2008，47（12）：917-919.

[6] 雷敬超，黃惠琴.南方根結(jié)線蟲生物防治研究進(jìn)展[J].中國生物防治，2007，23（增刊）：76-81.

[7] 李紀(jì)順，陳 凱，楊合同，等.伯克霍爾德氏菌B418的生物學(xué)特性[A].楊懷文.中國植物病理學(xué)會2004年學(xué)術(shù)年會論文集[C].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2004.

[8] 李善梅，李紀(jì)順，徐維生，等.生防菌劑YKT41及B418防治茄子根結(jié)線蟲病的田間試驗(yàn)[J].山東科學(xué)，2011，24（5）：10-13.

[9] 張炳欣，張 平，陳曉斌.影響引入微生物根部定殖的因素[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11（6）：951-953.

[10] 年洪娟，陳麗梅.土壤有益細(xì)菌在植物根際競爭定殖的影響因素[J].生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（6）：1235-1239.

2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知，B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，除氯仿和乙醚處理外，殺線蟲活性均有較大程度降低，其中乙酸乙酯處理活性降低最多，其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

3 小結(jié)與討論

越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株，具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí)，其定殖受環(huán)境（如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系）的影響[9，10]，制約著B418菌株的使用效果。因此，本試驗(yàn)對越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)，為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

通過對B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定，表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0～10.0，pH為7.0時(shí)活性最高，8 h最高校正死亡率為76.63%。另外，在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn)，初始pH為7.4時(shí)，接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降，但在7.0以上；6 h后pH持續(xù)上升，6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知，在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí)，可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用；乙醚處理殺線蟲活性雖然最高，因其有易揮發(fā)特性，可能存在溶劑相減少，樣品濃縮的可能，故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)

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[8] 李善梅，李紀(jì)順，徐維生，等.生防菌劑YKT41及B418防治茄子根結(jié)線蟲病的田間試驗(yàn)[J].山東科學(xué)，2011，24（5）：10-13.

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2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知，B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，除氯仿和乙醚處理外，殺線蟲活性均有較大程度降低，其中乙酸乙酯處理活性降低最多，其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

3 小結(jié)與討論

越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株，具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí)，其定殖受環(huán)境（如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系）的影響[9，10]，制約著B418菌株的使用效果。因此，本試驗(yàn)對越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)，為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

通過對B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定，表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0～10.0，pH為7.0時(shí)活性最高，8 h最高校正死亡率為76.63%。另外，在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn)，初始pH為7.4時(shí)，接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降，但在7.0以上；6 h后pH持續(xù)上升，6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知，在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí)，可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明，氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用；乙醚處理殺線蟲活性雖然最高，因其有易揮發(fā)特性，可能存在溶劑相減少，樣品濃縮的可能，故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

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[8] 李善梅，李紀(jì)順，徐維生，等.生防菌劑YKT41及B418防治茄子根結(jié)線蟲病的田間試驗(yàn)[J].山東科學(xué)，2011，24（5）：10-13.

[9] 張炳欣，張 平，陳曉斌.影響引入微生物根部定殖的因素[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11（6）：951-953.

[10] 年洪娟，陳麗梅.土壤有益細(xì)菌在植物根際競爭定殖的影響因素[J].生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（6）：1235-1239.