劉露穎　趙喜亭　李明軍

摘要：本文對(duì)秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物多倍體的誘導(dǎo)方法、影響多倍體誘導(dǎo)效果的因素及目前存在的問題進(jìn)行了綜述，為進(jìn)一步開展秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：秋水仙堿；藥用植物；多倍體；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S567.035.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0178-03

收稿日期：2013-08-20

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金（編號(hào)：2011M500457）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（編號(hào)：2011JS076）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃（編號(hào)：2010A180015）。

作者簡(jiǎn)介：劉露穎（1988—），女，河南信陽人，碩士研究生，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究。E-mail：liuluying2007@163.com。

通信作者：李明軍，博士，教授。E-mail：limingjun2002@263.net。多倍體植物是指具有3套或3套以上完整染色體組的個(gè)體[1]。由于其染色體數(shù)目加倍，個(gè)體常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)器官變大、抗逆能力增強(qiáng)等特征，在生物進(jìn)化與育種上具有重要意義。人們從植物資源中獲取食品、藥物及其他多種工業(yè)原料。目前世界各國(guó)對(duì)天然藥物需求和開發(fā)的不斷增加，使藥用植物面臨著日益嚴(yán)重的資源危機(jī)，尤其是以營(yíng)養(yǎng)器官為藥材的藥用植物資源危機(jī)更為嚴(yán)重。因此在有限的資源條件下，如何增加以收獲營(yíng)養(yǎng)器官為主的藥用植物的產(chǎn)量就成為研究的重點(diǎn)。多倍體藥用植物的獲得就成為主要途徑，因?yàn)槎啾扼w的營(yíng)養(yǎng)器官較正常植株大，且染色體是在原來基礎(chǔ)上整套加倍，不會(huì)造成原有藥用化學(xué)成分的丟失，相反會(huì)使原有藥用化學(xué)成分顯著增加[2-3]。多倍體誘導(dǎo)常用化學(xué)方法，所用的化學(xué)藥劑主要有秋水仙堿、水合三氯乙醛、笑氣、富民隆等。其中秋水仙堿只阻礙細(xì)胞分裂中期紡錘絲的形成，使細(xì)胞中與微管相關(guān)的功能受到阻礙和喪失，使有絲分裂被迫中斷[4]，但細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)并不分離從而導(dǎo)致同源染色體數(shù)目加倍，形成同源多倍體，其對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)并無太大影響，在遺傳上也很少出現(xiàn)其他不利的變異[1]。因此秋水仙堿被廣泛應(yīng)用，其誘導(dǎo)效果也較其他化學(xué)藥劑好。因此本文對(duì)近年來秋水仙堿在誘導(dǎo)藥用植物多倍體上的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1秋水仙堿誘導(dǎo)方法

秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物多倍體的方法有活體誘導(dǎo)法和離體誘導(dǎo)法兩種。

1.1活體誘導(dǎo)

活體誘導(dǎo)一般有浸種法、生長(zhǎng)點(diǎn)滴定法、涂抹法3種方法。近十年來秋水仙堿活體誘導(dǎo)藥用植物的例子見表1。

1.1.1浸種法浸種法，就是將植物種子完全浸入到適當(dāng)濃度的秋水仙堿溶液中，在適宜溫度下處理適宜時(shí)間獲得多倍體植株的方法。這種方法適用于以種子為繁殖材料的藥用植物，已在甘草種子[5]、菘藍(lán)種子[6]、牛蒡種子[7]、羅漢果種子[8]、新疆雪蓮種子[9]上進(jìn)行了研究（表1）。研究發(fā)現(xiàn)此法雖然簡(jiǎn)單易操作，但誘導(dǎo)率低，變異植株出現(xiàn)嵌合體的現(xiàn)象較嚴(yán)重，如甘草種子經(jīng)0.20%秋水仙堿處理24 h，誘導(dǎo)率僅為3.33%，且獲得的變異植株均為四倍體的嵌合體[5]；菘藍(lán)種子和牛蒡種子經(jīng)適當(dāng)濃度的秋水仙堿處理適宜時(shí)間后，雖然能獲得較高的誘導(dǎo)率（菘藍(lán)種子為37.5%、牛蒡種子為400%），但獲得的多倍體植株也均為嵌合體[6-7]。另外，這種方法使植物種子直接暴露在秋水仙堿溶液中，因此加大了秋水仙堿對(duì)植株的毒性作用，造成種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)困難，且死亡率高，羅漢果種子用0.1%的秋水仙堿浸泡48 h后就開始出現(xiàn)毒害現(xiàn)象[8]；用秋水仙堿浸泡新疆雪蓮種子獲得的絕大部分變異植株，其根系在生長(zhǎng)后期因秋水仙堿的毒害作用而受損，無法吸收營(yíng)養(yǎng)，最終導(dǎo)致死亡[9]。

2.1外植體

外植體的來源是影響秋水仙堿誘導(dǎo)效果的一個(gè)很重要的因素。在秋水仙堿處理植物體細(xì)胞染色體加倍試驗(yàn)中，外植體一般為愈傷組織、種子、芽、胚狀體、莖尖分生組織、試管苗及由花柄、葉片、花莖組織培養(yǎng)所得的原球莖[35]。此外，也有花粉[36]。不同植物誘導(dǎo)多倍體的適宜外植體不同[35]。天山雪蓮的適宜外植體為無菌苗[24]；南丹參的適宜外植體為葉片，誘導(dǎo)率可達(dá)33.33%[29]。在對(duì)百合的研究中發(fā)現(xiàn)，與鱗片[37]、無菌試管苗[38]、叢生芽[23]相比，不定芽是最為適宜的外植體，誘變率達(dá)50.0%[39]。另外，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外植體的發(fā)育時(shí)期也是影響誘導(dǎo)效果的一個(gè)重要因素。種子和芽可以在休眠狀態(tài)或代謝旺盛時(shí)期進(jìn)行處理，但生長(zhǎng)點(diǎn)處理時(shí)期越早，獲得的多倍體數(shù)目愈多，處理時(shí)間愈晚，則大多數(shù)出現(xiàn)嵌合體[40]。

2.2秋水仙堿濃度及處理時(shí)間

秋水仙堿的濃度和處理時(shí)間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙堿處理時(shí)，植物種類不同，其濃度和處理時(shí)間的最佳組合不同[41]。以浸泡法為例，非洲菊染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、8 h[42]；毛泡桐染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.05%、48 h[43]；長(zhǎng)春花染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.2%、24 h[44]；桉樹染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.21%、26.2 h[45]；盾葉薯蕷微塊莖加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.15%、24 h[46]；懷地黃染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、24 h[27]。菊花腦種子進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是 50 mg/L、48 h[40]；藥用百合叢生芽進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、72 h[23]；庫拉索蘆薈試管苗進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是0.06%、12 h，而對(duì)其莖段、葉片進(jìn)行秋水仙堿棉球覆蓋處理時(shí)，0.02%的秋水仙堿處理48 h為最適宜的濃度和時(shí)間組合[25]。這可能是由于不同來源的外植體對(duì)秋水仙堿的反應(yīng)、耐受能力及敏感程度不同所致。

3存在問題與展望

雖然在細(xì)胞有絲分裂過程中，秋水仙堿能夠阻止紡錘體的形成而使染色體加倍，但隨著研究的進(jìn)一步深入，用秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植株染色體加倍還存在著一些亟待解決的問題。endprint

首先，毒害問題。秋水仙堿對(duì)藥用植株的毒害作用主要表現(xiàn)在：抑制種子的萌發(fā)、根的生長(zhǎng)和不定芽的分化，甚至使材料在處理過程中死亡，另外處理后外植體在繼代培養(yǎng)中也容易褐化死亡。因此在處理藥用植物材料過程中篩選出最適宜的秋水仙堿濃度及處理時(shí)間顯得尤為關(guān)鍵，在保證誘導(dǎo)效果的情況下應(yīng)盡量減少秋水仙堿用量，縮短材料與秋水仙堿的接觸時(shí)間。

其次，嵌合體現(xiàn)象。由于分生組織細(xì)胞分裂的不同步性，用秋水仙堿處理后并不是所有細(xì)胞都可以加倍為多倍體，染色體未加倍的細(xì)胞與加倍的細(xì)胞嵌合在一起就形成了嵌合體。由于嵌合體現(xiàn)象嚴(yán)重，使得真正同一倍性的多倍體頻率過低，嚴(yán)重制約了藥用植物多倍體育種的發(fā)展。要從嵌合體中篩選出多倍體，可從形態(tài)上篩選出與正常植株有顯著差異的多倍體葉片等材料，通過組培手段獲得再生植株；或?qū)ζ渲仓赀M(jìn)行分離繁殖、多次繼代培養(yǎng)等方法消除嵌合體；也可直接將嵌合體解離為單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，再將判定為多倍體的單細(xì)胞挑出后直接再生形成植株。

因?yàn)槎啾扼w的產(chǎn)生受外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)、倍性水平，以及秋水仙堿的處理時(shí)間、濃度、溫度和滲透劑等因素的影響，要使秋水仙堿誘導(dǎo)成為藥用植物多倍體育種的一項(xiàng)成熟技術(shù)，還需要在更多的藥用植物上開展廣泛的研究。

盡管秋水仙堿在藥用植物多倍體誘導(dǎo)上還存在一些問題，但其在藥用植物的多倍體育種工作中也取得了較大的進(jìn)展，獲得了一些抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)的多倍體新品種[12-14]。隨著秋水仙堿誘導(dǎo)多倍體方法的成熟，以及與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，其在緩解藥用植物種質(zhì)退化、培育優(yōu)質(zhì)藥用植物品種等方面將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

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