楊冉+黃萍+祁珊珊+楊淞惠+杜道林

摘要：柳枝稷（Panicum virgatum L.）是一種理想的能源作物。以柳枝稷成熟種子為外植體，探索愈傷誘導(dǎo)過程中最佳外源激素配比，從而建立柳枝稷種子組培快繁體系。結(jié)果表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導(dǎo)率差異較大，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進(jìn)行誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)82%。

關(guān)鍵詞：柳枝稷；愈傷誘導(dǎo)；植株再生

中圖分類號(hào)：S943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0046-03

收稿日期：2013-07-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 （編號(hào)：31170386、31200316）；江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2011369、BE2012419）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（編號(hào)：2012M520999）；江蘇大學(xué)高級(jí)人才基金 （編號(hào)：09JDG020、11JDG150）。

作者簡(jiǎn)介：楊冉（1988—），男，河南信陽(yáng)人，碩士，主要從事能源植物新品種培育研究。E-mail：Ranyang0804@163.com。

通信作者：杜道林，博士，研究員，主要從事生態(tài)學(xué)研究。Tel：（0511）88790955；E-mail：ddl@ujs.edu.cn。柳枝稷（Panicum virgatum L.）為多年生草本C4植物，在北美洲廣泛種植[1]。柳枝稷植株高大，具有根系發(fā)達(dá)、防風(fēng)固沙能力強(qiáng)、耐瘠薄等優(yōu)點(diǎn)，是沙漠綠化的理想植物[2]。柳枝稷可合成燃料乙醇、甲醇、沼氣、氫氣等，由于其能源產(chǎn)出率高，在乙醇生產(chǎn)過程中易降解，被美國(guó)政府確定為替代玉米生產(chǎn)燃料乙醇的首選能源植物[3]。保存并快速繁殖優(yōu)質(zhì)材料是現(xiàn)代生物育種技術(shù)的重要研究?jī)?nèi)容。Xi等研究發(fā)現(xiàn)，柳枝稷是一種異型雜交的多倍體單子葉植物，具有高度的自交不親和性[4]。因此，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得具有高遺傳力的柳枝稷轉(zhuǎn)基因品種變得尤為重要，轉(zhuǎn)基因育種的前提是建立高效的植物組織培養(yǎng)體系?，F(xiàn)有的柳枝稷組培研究中，外植體多為葉片、莖尖、節(jié)間及幼穗，以這些材料作為外植體，愈傷誘導(dǎo)率普遍較低，且容易受生長(zhǎng)周期及季節(jié)限制。本研究以柳枝稷成熟種子為材料，探索愈傷誘導(dǎo)過程中最佳外源激素配比，從而建立柳枝稷種子組培快繁體系，旨在為開發(fā)利用柳枝稷資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

柳枝稷品種為Alamo（北京市農(nóng)林科學(xué)院），用自來水沖洗脫殼后的成熟種子，去掉雜質(zhì)，用無菌水浸泡12 h，沖洗后風(fēng)干，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制愈傷組織誘導(dǎo)及分化以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用3因素3水平進(jìn)行試驗(yàn)（表1），pH值為8.0。生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA（0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L）+3% 蔗糖+0.75% 瓊脂，pH值為8.0。配制完成后，121 ℃高壓滅菌15 min，待溫度冷卻至50～60 ℃時(shí)搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，置于超凈臺(tái)風(fēng)干備用。

1.2.2種子處理挑選干燥飽滿的種子，首先用6% NaClO溶液消毒2.5 h，輕輕攪動(dòng)使NaClO與種子充分接觸，然后用無菌水清洗3～5遍，浸泡12 h。之后用6% NaClO溶液消毒20 min，用無菌水清洗種子3～5遍[5]。在無菌條件下，將處理好的種子接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3培養(yǎng)條件選擇同一批成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及分化試驗(yàn)，每處理重復(fù)5次，每個(gè)培養(yǎng)皿中接種30粒種子，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)30～45 d后，選擇株高為2～4 cm的再生苗，切下幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，繼續(xù)置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)組培瓶接種12個(gè)外植體，每濃度重復(fù)4次，培養(yǎng)10～15 d。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗(yàn)因素及水平見表1。GZX-300BS-4光照培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）培養(yǎng)溫度設(shè)置為24 ℃，光照培養(yǎng)時(shí)間為16 h/d，光照強(qiáng)度為12 000 lx。

1.2.4生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定接種后，每3 d統(tǒng)計(jì)1次胚芽數(shù)目、胚根出現(xiàn)時(shí)間及數(shù)目、愈傷組織出現(xiàn)時(shí)間及數(shù)目等指標(biāo)。培養(yǎng)30～45 d后，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率及愈傷誘導(dǎo)率，確定最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況，觀察并統(tǒng)計(jì)分化出的不定芽生

2結(jié)果與分析

2.1不同激素配比對(duì)種子萌發(fā)時(shí)間及萌發(fā)率的影響

由表2可知，培養(yǎng)5～7 d后，大多數(shù)種子都能在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)，且不同濃度激素對(duì)柳枝稷種子的萌發(fā)時(shí)間及萌發(fā)率均有顯著影響。當(dāng)2，4-D濃度為6 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L、NAA濃度為0.6 mg/L時(shí)，種子接種后3 d即開始萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)82%。當(dāng)2，4-D濃度為 6 mg/L、6-BA濃度為1.5 mg/L、NAA濃度為1.2 mg/L時(shí)，種子萌發(fā)時(shí)間延遲，接種后7 d才開始萌發(fā)，且萌發(fā)率僅為35%。由此可知，柳枝稷種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 6 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

2.2不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)的影響

經(jīng)消毒處理的成熟種子培養(yǎng)5 d后，部分培養(yǎng)基上開始有愈傷組織形成，隨后逐漸變大，并且隨著愈傷組織的增大其表面逐漸變得干燥，質(zhì)地緊密結(jié)實(shí)，顏色多為黃色、嫩綠色（圖1-a）。當(dāng)2，4-D濃度為2mg/L、6-BA濃度為

0.5 mg/L、NAA濃度為1.2 mg/L時(shí)，形成愈傷組織所需的時(shí)間最長(zhǎng)，即培養(yǎng)12 d后才能觀察到愈傷組織的形成。不同激素配比下，外植體愈傷組織的長(zhǎng)勢(shì)也有顯著差別（圖1-b）。在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，不同激素配比處理下愈傷組織在色澤、大小等指標(biāo)方面差異較大，愈傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)82%，最低僅為35%（表2）。一部分愈傷組織色澤淡黃，體積較小且表面干燥疏松；另一部分愈傷組織色澤嫩綠，體積較大且表面緊實(shí)，具有較強(qiáng)的再分化能力，可用于誘導(dǎo)成苗。這些生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織培養(yǎng)一段時(shí)間后體積逐漸增大，且伴隨出現(xiàn)一些白色顆粒狀胚狀體。繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，有些原本白色的胚狀體凸起，分化為嫩綠色的幼芽（圖1-c）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，新形成的幼芽逐漸變綠，并且直立生長(zhǎng)，有的幼芽長(zhǎng)勢(shì)較快，接種到培養(yǎng)基上15 d后可長(zhǎng)至2～3 cm。體積較小的愈傷組織接種一段時(shí)間后，分化出一些零星的幼芽，隨后幼芽停止生長(zhǎng)。將切割后的分化組織接種到新培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，有的芽能長(zhǎng)出長(zhǎng)約4～6 cm的新葉，并從嫩綠色變成翠綠色（圖1-d）。愈傷組織誘導(dǎo)及分化的最佳培養(yǎng)基為MS+6 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.75% 瓊脂，pH值為8.0。

2.3不同濃度NAA對(duì)不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導(dǎo)及分化的最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)（圖1-e）。結(jié)果表明，當(dāng) NAA濃度為 0.8 mg/L 時(shí)，生根時(shí)間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達(dá)90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導(dǎo)出 15～20 條新生根（圖1-f）。當(dāng)NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時(shí)，新根都會(huì)延遲出現(xiàn)。在生根的同時(shí)，新生苗新葉長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1-g），平均長(zhǎng)約 10 cm，部分甚至高達(dá)20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當(dāng)大部分新生苗長(zhǎng)出數(shù)量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后將培養(yǎng)基取出置于室溫下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基表面加入少許無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，將新苗從培養(yǎng)基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后，將花盆搬至室外繼續(xù)培養(yǎng)煉苗（圖1-h）。當(dāng)培養(yǎng)條件適合時(shí)，大部分幼苗都能正常存活，并且穩(wěn)定生長(zhǎng)（圖1-i）。

3結(jié)論

Gupta等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D、TDZ結(jié)合使用對(duì)柳枝稷愈傷組織的形成起促進(jìn)作用[6]。Denchev等認(rèn)為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對(duì)柳枝稷的愈傷誘導(dǎo)、分化再生有明顯影響[7]。傳統(tǒng)的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化及生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)，且產(chǎn)率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，包括愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)[8]。在愈傷誘導(dǎo)過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質(zhì)量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對(duì)愈傷組織形成有比較明顯的促進(jìn)作用，很少被植物細(xì)胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細(xì)胞分裂素結(jié)合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導(dǎo)率差異較大，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)82%。愈傷組織誘導(dǎo)增殖后，在最佳激素配比培養(yǎng)基上可直接進(jìn)行分化培養(yǎng)，能進(jìn)一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時(shí)間，節(jié)約了試驗(yàn)成本，提高了效率。室內(nèi)煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養(yǎng)，可正常存活。

參考文獻(xiàn)：

[1]王勇鋒，柴乖強(qiáng)，徐開杰，等. 柳枝稷成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，21（6）：140-145.

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[12]Ramamoorthy R，Kumar P P. A simplified protocol for genetic transformation of switchgrass（Panicum virgatum L.）[J]. Plant Cell Reports，2012，31（10）：1923-1931.

2.3不同濃度NAA對(duì)不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導(dǎo)及分化的最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)（圖1-e）。結(jié)果表明，當(dāng) NAA濃度為 0.8 mg/L 時(shí)，生根時(shí)間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達(dá)90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導(dǎo)出 15～20 條新生根（圖1-f）。當(dāng)NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時(shí)，新根都會(huì)延遲出現(xiàn)。在生根的同時(shí)，新生苗新葉長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1-g），平均長(zhǎng)約 10 cm，部分甚至高達(dá)20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當(dāng)大部分新生苗長(zhǎng)出數(shù)量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后將培養(yǎng)基取出置于室溫下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基表面加入少許無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，將新苗從培養(yǎng)基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后，將花盆搬至室外繼續(xù)培養(yǎng)煉苗（圖1-h）。當(dāng)培養(yǎng)條件適合時(shí)，大部分幼苗都能正常存活，并且穩(wěn)定生長(zhǎng)（圖1-i）。

3結(jié)論

Gupta等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D、TDZ結(jié)合使用對(duì)柳枝稷愈傷組織的形成起促進(jìn)作用[6]。Denchev等認(rèn)為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對(duì)柳枝稷的愈傷誘導(dǎo)、分化再生有明顯影響[7]。傳統(tǒng)的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化及生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)，且產(chǎn)率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，包括愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)[8]。在愈傷誘導(dǎo)過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質(zhì)量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對(duì)愈傷組織形成有比較明顯的促進(jìn)作用，很少被植物細(xì)胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細(xì)胞分裂素結(jié)合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導(dǎo)率差異較大，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)82%。愈傷組織誘導(dǎo)增殖后，在最佳激素配比培養(yǎng)基上可直接進(jìn)行分化培養(yǎng)，能進(jìn)一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時(shí)間，節(jié)約了試驗(yàn)成本，提高了效率。室內(nèi)煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養(yǎng)，可正常存活。

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[11]Gupta S D，Conger B V. In vitro differentiation of multiple shoot clumps from intact seedlings of switchgrass[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology：Plant，1998，34（3）：196-202.

[12]Ramamoorthy R，Kumar P P. A simplified protocol for genetic transformation of switchgrass（Panicum virgatum L.）[J]. Plant Cell Reports，2012，31（10）：1923-1931.

2.3不同濃度NAA對(duì)不定芽生根的影響

在愈傷組織誘導(dǎo)及分化的最佳培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長(zhǎng)勢(shì)較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)（圖1-e）。結(jié)果表明，當(dāng) NAA濃度為 0.8 mg/L 時(shí)，生根時(shí)間最短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達(dá)90%以上（表3），每棵再生苗均能誘導(dǎo)出 15～20 條新生根（圖1-f）。當(dāng)NAA濃度過低（0.4 mg/L）或者過高（1.6 mg/L）時(shí)，新根都會(huì)延遲出現(xiàn)。在生根的同時(shí)，新生苗新葉長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1-g），平均長(zhǎng)約 10 cm，部分甚至高達(dá)20 cm（圖1-g）。

2.4煉苗

當(dāng)大部分新生苗長(zhǎng)出數(shù)量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后將培養(yǎng)基取出置于室溫下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基表面加入少許無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，將新苗從培養(yǎng)基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長(zhǎng)勢(shì)穩(wěn)定后，將花盆搬至室外繼續(xù)培養(yǎng)煉苗（圖1-h）。當(dāng)培養(yǎng)條件適合時(shí)，大部分幼苗都能正常存活，并且穩(wěn)定生長(zhǎng)（圖1-i）。

3結(jié)論

Gupta等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D、TDZ結(jié)合使用對(duì)柳枝稷愈傷組織的形成起促進(jìn)作用[6]。Denchev等認(rèn)為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對(duì)柳枝稷的愈傷誘導(dǎo)、分化再生有明顯影響[7]。傳統(tǒng)的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化及生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)，且產(chǎn)率較低。許文志等利用柳枝稷成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，包括愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根等環(huán)節(jié)，耗時(shí)較長(zhǎng)[8]。在愈傷誘導(dǎo)過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質(zhì)量，提高植物分化再生頻率[9]。有研究表明，2，4-D對(duì)愈傷組織形成有比較明顯的促進(jìn)作用，很少被植物細(xì)胞所代謝[10]，且不同濃度的 2，4-D與其他一些細(xì)胞分裂素結(jié)合，可以建立高效組培體系[11]。NAA是廣譜型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴(kuò)大，誘導(dǎo)分化組織形成不定根[12]。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導(dǎo)率差異較大，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)82%。愈傷組織誘導(dǎo)增殖后，在最佳激素配比培養(yǎng)基上可直接進(jìn)行分化培養(yǎng)，能進(jìn)一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時(shí)間，節(jié)約了試驗(yàn)成本，提高了效率。室內(nèi)煉苗 7 d 后，將柳枝稷新生苗移至室外培養(yǎng)，可正常存活。

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