劉海青　劉富平　胡文婷

摘要：為獲得低毒廉價(jià)新型魚藥，采用牛津杯法和試管二倍稀釋法分別測(cè)定壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿對(duì)溶珊瑚弧菌、塔氏弧菌、鯊魚弧菌的敏感性、最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并與對(duì)照環(huán)丙沙星進(jìn)行比較。結(jié)果表明，壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿對(duì)3種弧菌的體外抗菌活性與環(huán)丙沙星相近。

關(guān)鍵詞：壯實(shí)鹿角珊瑚；生物堿；病原性海洋弧菌；體外抗菌活性

中圖分類號(hào)： S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0250-02

收稿日期：2013-05-30

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：IRT1123）；海南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究資助（編號(hào)：Hjkj）；海南大學(xué)青年基金（編號(hào)：qnjj1151）。

作者簡(jiǎn)介：劉海青（1971—），女，山西大同人，碩士研究生，副教授，從事天然產(chǎn)物活性研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。

通信作者：劉富平（1974—），男，山西榆次人，博士，副教授，從事微生物制藥研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。病原性海洋弧菌是一群在海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的條件致病菌。霍亂弧菌和副溶血弧菌是引起人類細(xì)菌性食物中毒的首要食源性致病菌[1]，大部分魚類易患的弧菌病一般由溶藻弧菌所引起[2]，溶珊瑚弧菌則會(huì)導(dǎo)致雜色鮑幼苗急性死亡脫落癥大規(guī)模暴發(fā)，其毒性比溶藻弧菌更強(qiáng)[3]。為了預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病，大量抗生素類藥物被用作水產(chǎn)藥物，但長(zhǎng)期過(guò)度使用又使得菌株的耐藥性和抗生素殘留問(wèn)題日益突出。來(lái)源于自然界的生物堿類化合物資源豐富、抗菌譜廣，對(duì)包括耐藥菌在內(nèi)的菌株抗菌效果良好。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚所處環(huán)境雖艱難惡劣卻極少被魚類或其他生物捕食，而且能夠排斥海藻生長(zhǎng)，防止其他生物棲息，具有自身產(chǎn)生的各種次生代謝產(chǎn)物構(gòu)建的防御體系[4]。所以，本研究以海南島蜈支洲海域壯實(shí)鹿角珊瑚為試驗(yàn)材料，提取生物堿及其他含氮雜環(huán)，以對(duì)水產(chǎn)品危害較大的致病弧菌為受試菌種進(jìn)行抗菌活性篩選，希望獲得低毒廉價(jià)的抗菌活性良好的化合物，應(yīng)用于弧菌病害的防治。

1材料與方法

1.1受試菌種

溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）、塔氏弧菌（Vibrio tubiashii）、鯊魚弧菌（Vibrio carchariae）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所提供。壯實(shí)鹿角珊瑚（Acropora robusta）采自海南島蜈支洲海域。

1.2培養(yǎng)基的制備

液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母浸出膏1 g、磷酸鐵0.01 g、過(guò)濾陳海水1 000 mL，pH值為7.6～7.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 備用。

固體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g、酵母浸出膏1 g、磷酸鐵0.01 g、瓊脂粉18 g、過(guò)濾陳海水1 000 mL，pH 值為7.6～7.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3藥液的制備

1.3.1體外抑菌試驗(yàn)藥液的配制準(zhǔn)確稱取適量的藥品，用無(wú)菌蒸餾水分別配制成濃度為500、1 000 μg/mL 的藥液各100 mL，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后分裝，使用前配制。

1.3.2抗生素后效應(yīng)（PAE）藥液的配制用上述方法配制100、200、400倍的MIC（最小抑菌濃度）的各種藥液，121 ℃高壓蒸汽滅菌20min，-20 ℃貯存?zhèn)溆?，臨用前稀釋到所需要的倍數(shù)。

1.4鹿角珊瑚生物堿的提取

稱取濕重壯實(shí)鹿角珊瑚4 kg的樣品，粉碎，分為4份，每份1 kg，分別加入珊瑚樣品10倍量的1%HCl、30%乙醇、70%乙醇、90%乙醇，回流提取1 h。記錄每份提取液的體積，采用HPLC法測(cè)定珊瑚生物堿含量，以珊瑚生物堿含量作為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，以70%乙醇提取的珊瑚生物堿含量較高。另以50%、60%、70%乙醇回流提取珊瑚樣品，結(jié)果表明，以60%乙醇提取的珊瑚生物堿含量最高，所以確定采用60%乙醇為后續(xù)試驗(yàn)提取溶媒。

稱取10 kg濕重鹿角珊瑚，粉碎，加入珊瑚樣品8倍量的60%乙醇回流提取2 h，提取3次，過(guò)濾，合并3次濾液，減壓回收乙醇至干，得浸膏。浸膏經(jīng)硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜分離，分別用三氯甲烷-甲醇（100 ∶0→0 ∶100）、石油醚-丙酮（100 ∶0→0 ∶100）、水-甲醇（100 ∶100 →0 ∶100）梯度洗脫，洗脫物再經(jīng)反復(fù)分離純化，重結(jié)晶，得到生物堿10 mg，碘化鉍鉀試劑定性鑒定。

1.5體外抑菌試驗(yàn)

1.5.1藥物敏感性測(cè)定將3株供試菌分別劃線接種于平皿培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)24 h；挑選單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng) 24 h；用 2 mL 0.9% NaCl溶液進(jìn)行洗脫即制得所需菌懸液。

采用牛津杯法對(duì)2種藥物進(jìn)行敏感性測(cè)定試驗(yàn)。吸取培養(yǎng) 8～10 h 的 3 種弧菌菌液 0.1 mL，分別均勻涂布在直徑為 9 cm 的平板培養(yǎng)基表面，蓋好平皿，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中約放置20 min。待培養(yǎng)基表面稍干后，用無(wú)菌鑷子夾取牛津杯分別置于平板表面，使牛津杯與培養(yǎng)基緊密接觸，每個(gè)平板表面放4個(gè)牛津杯，每種藥液加 2 杯作為平行樣，每杯加 200 μL 500 μg/mL的各種藥液，置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量牛津杯周圍各種藥物抑菌圈的直徑，每杯取不同方向測(cè)量 2 次，最后求平均值。每種藥物均試驗(yàn) 2 次，按藥物敏感度標(biāo)準(zhǔn)判定敏感度。

1.5.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定試管2倍稀釋法略作改進(jìn)，以環(huán)丙沙星為陽(yáng)性對(duì)照。endprint

2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對(duì)2種抗菌藥物的敏感性定性試驗(yàn)

試驗(yàn)藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對(duì)致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對(duì)3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對(duì)溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說(shuō)明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對(duì)氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實(shí)，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長(zhǎng)[12]。本研究通過(guò)對(duì)藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿對(duì)3 種試驗(yàn)菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說(shuō)明可以進(jìn)一步對(duì)該生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]夏凡，楊麗君，王靜，等. 病原性海洋弧菌致病機(jī)理及其快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2011，32（1）：366-370，376.

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[11]劉遠(yuǎn)飛，體恒敏，韓建春. 單諾沙星和恩諾沙星對(duì)大腸桿菌和金葡球菌的抗菌后效應(yīng)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2003，39（7）：19-20.

[12]胡大強(qiáng)，陳雅. 氟喹諾酮藥物的抗生素后效應(yīng)研究概況[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2004，13（1）：76-77.石桃雄，顧亮亮，陳澤林，等. 金蕎收集系葉片黃酮、可溶性蛋白、可溶性糖含量分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：252-255.

2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對(duì)2種抗菌藥物的敏感性定性試驗(yàn)

試驗(yàn)藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對(duì)致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對(duì)3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對(duì)溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說(shuō)明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對(duì)氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實(shí)，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長(zhǎng)[12]。本研究通過(guò)對(duì)藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿對(duì)3 種試驗(yàn)菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說(shuō)明可以進(jìn)一步對(duì)該生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

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[12]胡大強(qiáng)，陳雅. 氟喹諾酮藥物的抗生素后效應(yīng)研究概況[J]. 中國(guó)藥業(yè)，2004，13（1）：76-77.石桃雄，顧亮亮，陳澤林，等. 金蕎收集系葉片黃酮、可溶性蛋白、可溶性糖含量分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：252-255.

2結(jié)果與分析

2.1藥物的敏感性

藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑（D）>20 mm，極度敏感；15 mm≤D≤20 mm，高度敏感；10 mm≤D≤14 mm，中度敏感；0

表13種海洋致病弧菌對(duì)2種抗菌藥物的敏感性定性試驗(yàn)

試驗(yàn)藥物1抑菌圈直徑（mm）溶珊瑚弧菌1 塔氏弧菌1鯊魚弧菌環(huán)丙沙星124.8122.6121.8鹿角珊瑚生物堿121.8118.8119.3

2.2藥物對(duì)致病弧菌的PAE

由表2可以看出，環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MIC均在2～3.9 μg/mL 之間，鹿角珊瑚生物堿對(duì)3株弧菌的MIC較低，在 1.4～3.9 μg/mL 之間，表現(xiàn)出了較好的抑菌效果；鹿角珊瑚生物堿對(duì)溶珊瑚弧菌的MIC達(dá)到1.4 μg/mL，抑菌效果優(yōu)于環(huán)丙沙星。環(huán)丙沙星對(duì)3株菌的MBC均比鹿角珊瑚生物堿低；環(huán)丙沙星的MBC/MIC 值為2.0～2.6，鹿角珊瑚生物堿的MBC/MIC 值為3.0～3.3，說(shuō)明鹿角珊瑚生物堿的殺菌效果與環(huán)丙沙星接近。表22 種抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌株的MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果

藥物1溶珊瑚弧菌1塔氏弧菌1鯊魚弧菌MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）1MIC（μg/mL）1MBC（μg/mL）環(huán)丙沙星12.014.013.118.213.918.9鹿角珊瑚生物堿11.414.513.6110.813.9112.8

3結(jié)論

人類醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)對(duì)氟喹諾酮類藥物的研究結(jié)果[5-11]證實(shí)，氟喹諾酮類藥物抑菌、殺菌作用在很大范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系，并且抗菌后效應(yīng)期也較長(zhǎng)[12]。本研究通過(guò)對(duì)藥物敏感性及最小抑菌濃度和最小殺菌濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，壯實(shí)鹿角珊瑚生物堿對(duì)3 種試驗(yàn)菌株的抗菌活性與環(huán)丙沙星比較接近。說(shuō)明可以進(jìn)一步對(duì)該生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定及修飾，為開發(fā)一種新的水產(chǎn)魚藥提供新思路。

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