劉海青 劉富平 胡文婷

摘要：采用富集平板稀釋法、剛果紅染色法選育壯實(shí)鹿角珊瑚纖維素分解菌，用DNS法測(cè)定菌株降解纖維素酶活。結(jié)果表明，壯實(shí)鹿角珊瑚體內(nèi)含有共附生纖維素分解菌，該菌可分泌降解纖維素酶，富集培養(yǎng)及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。

關(guān)鍵詞：壯實(shí)鹿角珊瑚；纖維素；生物質(zhì)

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）02-0329-02

收稿日期：2013-05-29

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（編號(hào)：IRT1123）；海南省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：Hjkj2008-15）；海南大學(xué)青年基金（編號(hào)：qnjj1151）。

作者簡(jiǎn)介：劉海青（1971—），女，山西大同人，碩士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物活性研究。Tel：（0898）66289567；E-mail：892035892@qq.com。

通信作者：劉富平，博士，副教授，主要從事微生物制藥研究。生物質(zhì)是唯一可以轉(zhuǎn)化為液體燃料的可再生能源[1]，以木屑、農(nóng)作物秸稈、椰殼等生物質(zhì)為原料的纖維素乙醇，不僅避免了生物乙醇與人爭(zhēng)糧爭(zhēng)地的弊端，而且燃放時(shí)釋放的溫室氣體與燃燒汽油相比少90%[2]。微生物是纖維素酶的主要來(lái)源[3]，分離、選育出針對(duì)不同行業(yè)的高效降解纖維素菌種，促使纖維素資源化利用已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[4]。海洋微生物資源豐富，許多微生物寄生在珊瑚體內(nèi)或附著在珊瑚表面，與珊瑚協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中二者形成了互惠關(guān)系[5]。海洋高鹽、高壓、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)等獨(dú)特的環(huán)境賦予了海洋微生物獨(dú)特的代謝途徑[6]。珊瑚共附生菌不僅能夠獨(dú)立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，還可分泌具有各種功能的活性酶，參與珊瑚次生成分的合成，或?qū)ι汉鞔紊x產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化[7]，是天然產(chǎn)物新的來(lái)源。本研究選育壯實(shí)鹿角珊瑚纖維素分解菌，旨在為促進(jìn)纖維素資源化利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

壯實(shí)鹿角珊瑚樣品采自海南島蜈支洲近海海域。富集培養(yǎng)基（CMC）：KH2PO4 0.2% 、MgSO4 0.015%、KNO3 0.1%、CMC-Na 1%，共100 mL。馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g、葡萄糖10 g、NaCl 5 g、瓊脂7.5～100 g、無(wú)菌水500 mL、pH值自然，共500 mL。真菌初篩培養(yǎng)基：K2HPO4 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、NaCl 6 g、CMC-Na 15 g、瓊脂粉 1.5%、（NH4）2SO4 2.0 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 0.5 g、pH值70～74、蒸餾水1 000 mL。真菌保種培養(yǎng)基：真菌培養(yǎng)基（PDA）。甲液：將6.9 g結(jié)晶苯酚溶于15.2 mL 10% NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亞硫酸氫鈉。乙液：將255 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% NaOH溶液中，再加入880 mL 1% 3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲乙溶液混合即得黃色試劑，儲(chǔ)于棕色瓶中放置7～10 d后使用。溶液在棕色瓶?jī)?nèi)保存1年有效。

1.2方法

1.2.1壯實(shí)鹿角珊瑚樣品懸液的制備將30 g壯實(shí)鹿角珊瑚樣品加少量水磨碎后轉(zhuǎn)移至盛有10 mL CMC富集培養(yǎng)液中，靜置。

1.2.2纖維素降解菌的富集培養(yǎng)取以上壯實(shí)鹿角珊瑚樣品懸液10 mL轉(zhuǎn)入無(wú)菌三角瓶中，30 ℃下振蕩培養(yǎng)1～3 d，按2%的接種量，取0.2 mL菌液轉(zhuǎn)接至10 mL新富集培養(yǎng)基CMC2中進(jìn)行第2次富集培養(yǎng)。

1.2.3纖維素降解菌的篩選分別取富集培養(yǎng)后的2種菌懸液各1 mL做系列稀釋，稀釋105～107倍，每種菌液取 0.1 mL 分別涂布于真菌培養(yǎng)基PDA及細(xì)菌選擇平板，每種稀釋倍數(shù)做3個(gè)平行板，平板于30 ℃下恒溫培養(yǎng)1～3 d，以平板上出現(xiàn)均勻的單菌落為準(zhǔn)。待長(zhǎng)出單菌落后（以40個(gè)單菌落為準(zhǔn)）選取4個(gè)平板。用接種環(huán)挑選單菌落點(diǎn)種在真菌及細(xì)菌初篩培養(yǎng)基上，每板接種5株菌株。每株菌株點(diǎn)種2個(gè)平板，1個(gè)平板用于剛果紅染色，另一個(gè)作為保存平板。

1.2.4纖維素降解菌的初步鑒定剛果紅染色法：30 ℃培養(yǎng)1～3 d后，測(cè)量并記錄各菌落直徑后用70%乙醇將菌落洗下，然后用0.1%剛果紅浸染30 min，傾去染液，再用1 mol/L NaCl浸泡脫色30 min，傾去NaCl浸泡液，觀察菌落周圍有無(wú)透明圈，若有透明圈，測(cè)量并記錄透明圈的直徑，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（HC值）。

1.2.5纖維素降解菌的分離純化挑選HC值大于1的菌株作為初篩菌種，通過(guò)連續(xù)劃線法分離純化菌株，將鏡檢后得到的初篩菌株轉(zhuǎn)接到保種培養(yǎng)基保藏斜面，4 ℃下保藏備用。

2結(jié)果與分析

2.1纖維素降解菌的篩選

采用以CMC-Na為唯一碳源富集平板稀釋分離，圖1、圖2為壯實(shí)鹿角珊瑚真菌第3天至第8天的生長(zhǎng)變化過(guò)程，第3天培養(yǎng)基上長(zhǎng)出1個(gè)圓斑，營(yíng)養(yǎng)菌絲呈圓形晶亮白色放射狀，中間有1個(gè)黑色孢子囊，孢子囊逐漸向周圍擴(kuò)散，覆蓋了白色菌絲。

2.2纖維素降解菌的初步鑒定

經(jīng)剛果紅染色法初步鑒定，分離到1株具有降解纖維素能力的真菌，試驗(yàn)表明，纖維素降解菌染色后能在纖維素瓊脂培養(yǎng)基上快速產(chǎn)生清亮的透明圈，HC值>1（圖3、圖4）。

3結(jié)論與討論

本研究表明，壯實(shí)鹿角珊瑚體內(nèi)含有共附生纖維素分解菌，該菌可分泌降解纖維素酶，富集培養(yǎng)及剛果紅染色法可有效篩選此類活性菌株。筆者最初采用羧甲基纖維素鈉CMC-Na-剛果紅培養(yǎng)基進(jìn)行纖維素降解菌初篩，但是菌株無(wú)法在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)且不能產(chǎn)生透明圈，所以改用富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接到真菌初篩培養(yǎng)基上，再用剛果紅染色法染色，1～2 d后可以看到清晰的透明圈，說(shuō)明此菌株只能以先培養(yǎng)后剛果紅染色的方法進(jìn)行初步鑒定。

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