王麗娟,劉軍英,劉惠濤

(煙臺(tái)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

鹽酸二甲雙胍(Metformin Hydrochloride)又名1,1-二甲基雙胍鹽酸鹽,為雙胍類口服降血糖藥,治療非胰島素依賴型糖尿病[1]，主要作用于胰島外組織,抑制腸吸收葡萄糖[2]．雙氰胺(Cyanoguanidine,CGD)和三聚氰胺(Melamine,MEL)都是鹽酸二甲雙胍的合成中間體(圖 1),毒性較大,必須嚴(yán)格控制其在藥品中的含量,保證患者用藥安全、有效，目前規(guī)定其限量分別為0.02%和0.1%[3]．

雙氰胺和三聚氰胺的檢測(cè)方法包括氣相色譜[4]、高效液相色譜[3,5-10]、薄層層析[11]、毛細(xì)管電泳[12-13]和表面增強(qiáng)拉曼散射光譜法[14]等．但采用簡(jiǎn)單的反相HPLC法同時(shí)測(cè)定鹽酸二甲雙胍中的雙氰胺和三聚氰胺含量的方法還未見(jiàn)報(bào)道．本文使用C18反相色譜柱,通過(guò)對(duì)離子對(duì)試劑的種類、配比、pH值等因素的系統(tǒng)考察,建立一種測(cè)定鹽酸二甲雙胍制劑中的雜質(zhì)雙氰胺和三聚氰胺的離子對(duì)色譜法．

圖1 雙氰胺和三聚氰胺的結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1525型高效液相色譜儀,配有Waters 2487型紫外檢測(cè)器,美國(guó)Waters 公司;pH/Lon 510型酸度計(jì),新加坡Crison公司,型號(hào)pH 5500,精度0.01個(gè)pH單位;雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),型號(hào)TU-1901,北京普析通用儀器有限公司;超聲波清洗儀,型號(hào)SK3300HP,上海科導(dǎo)超聲有限公司;分析天平,型號(hào)AL-204,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司．

雙氰胺對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院),三聚氰胺對(duì)照品(Dr. Ehrenstorfer股份有限公司(德國(guó))),庚烷磺酸鈉、戊烷磺酸鈉、乙腈、甲醇均為色譜純,檸檬酸為分析純,鹽酸二甲雙胍片2批,樣品① 批號(hào):H11021518,樣品② 批號(hào):H20060614．實(shí)驗(yàn)用水均為超純水．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18反相色譜柱 (5 μm; 250×4.6 mm);流動(dòng)相:乙腈-離子對(duì)試劑水溶液(10 mmol/L戊烷磺酸鈉+10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0，體積比10∶90);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):217 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25 ℃．

1.2.2 溶液的制備 雙氰胺對(duì)照品溶液:取雙氰胺對(duì)照品約5 mg,精密稱定,置5 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,得雙氰胺對(duì)照品儲(chǔ)備液．

三聚氰胺對(duì)照品溶液:取三聚氰胺對(duì)照品約5 mg,精密稱定,置10 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,得三聚氰胺對(duì)照品儲(chǔ)備液．

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別精密量取雙氰胺對(duì)照品儲(chǔ)備液和三聚氰胺對(duì)照品儲(chǔ)備液各1.0 mL,置100 mL容量瓶中,加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,制成每1 mL中約含雙氰胺10 μg和三聚氰胺5 μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液．

供試品溶液:取鹽酸二甲雙胍片樣品① 、②各3片,精密稱定,研細(xì),精密稱取適量(約相當(dāng)于鹽酸二甲雙胍500 mg),置100 mL容量瓶中,加超純水20 mL,超聲處理15 min后流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,過(guò)濾．所用溶液分析前均經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾．

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 經(jīng)過(guò)紫外雙光束分光光度計(jì)掃描(190～400 nm),得到雙氰胺的最大吸收波長(zhǎng)是217 nm,三聚氰胺的最大吸收波長(zhǎng)是204 nm．而國(guó)標(biāo)中三聚氰胺的檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm,因此分別測(cè)定217 nm和240 nm波長(zhǎng)下的色譜,離子對(duì)試劑為戊烷磺酸鈉,對(duì)乙腈的體積比為90∶10,試驗(yàn)濃度為10 mmol/L(含10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0),結(jié)果顯示在240 nm下CGD 和MLN的吸收峰均較弱,因此選擇217 nm為2種物質(zhì)的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)．

2.1.2 離子對(duì)試劑種類的選擇 選用的離子對(duì)試劑為戊烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉,試驗(yàn)濃度為10 mmol/L(含10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0),對(duì)乙腈的體積比為90∶10．結(jié)果顯示,使用戊烷磺酸鈉最為離子對(duì)試劑的保留時(shí)間更短,且分離良好．綜合考慮溶劑峰與雙氰胺峰的分離度以及保留時(shí)間的差異,最終選擇戊烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑．

2.1.3 離子對(duì)試劑pH值的選擇 以戊烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑,濃度為10 mmol/L,與乙腈體積比為90∶10,分別考察了pH值為2.5、3.0、3.5、4.0不同條件下的分離情況．結(jié)果顯示,在不同pH值條件下,雙氰胺的保留時(shí)間均變化不顯著,而三聚氰胺的保留時(shí)間隨pH值增大而延長(zhǎng),pH值為2.5和4.0時(shí)雙氰胺與溶劑峰不能分離,當(dāng)流動(dòng)相pH值為3.0時(shí)雙氰胺和三聚氰胺具有最佳分離和最短分析時(shí)間,因此選擇離子對(duì)試劑溶液的pH值為3.0．

2.1.4 流動(dòng)相比例的選擇 采用10 mmol/L的戊烷磺酸鈉(pH值為3.0),分別考察了流動(dòng)相中離子對(duì)試劑與乙腈的體積比為85∶15、90∶10、95∶5的不同實(shí)驗(yàn)條件下,雙氰胺和三聚氰胺的分離度．結(jié)果顯示,流動(dòng)相比例為90∶10時(shí)雙氰胺和三聚氰胺具有最佳分離,因此選擇流動(dòng)相的比例為90∶10．

綜上所述,最優(yōu)分離條件為乙腈-離子對(duì)試劑水溶液(10 mmol/L戊烷磺酸鈉+10 mmol/L檸檬酸,pH值為3.0，體積比10∶90)．

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 線性 分別配制雙氰胺和三聚氰胺一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在最優(yōu)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定,以峰面積對(duì)組分濃度分別作圖,在0.02～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)得到雙氰胺回歸方程為A雙氰胺=229 028c雙氰胺+528.24,R=0.999 9;在0.02～50 μg/mL濃度范圍內(nèi),三聚氰胺回歸方程是A三聚氰胺=159 033c三聚氰胺+16 650,R=0.999 9．表明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性良好．

2.2.2 檢出限和定量限 取對(duì)照品溶液稀釋到合適濃度,進(jìn)樣,以信噪比的3倍和10倍計(jì)算檢出限和定量限．雙氰胺的檢出限為4.0 ng/mL,定量限為15.0 ng/mL;三聚氰胺的檢出限為6.0 ng/mL,定量限為20.0 ng/mL．

2.2.3 精密度 取2種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液日內(nèi)和日間連續(xù)進(jìn)樣5次,計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度,結(jié)果如表1所示．

2.3 樣品測(cè)定

在上述優(yōu)化的色譜條件下,對(duì)鹽酸二甲雙胍片中的三聚氰胺和雙氰胺的雜質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2中b、c所示．2種批號(hào)的藥品中均未檢出三聚氰胺和雙氰胺．

表1 HPLC測(cè)定CGD和MLN的精密度(n=5)

圖2 空白、標(biāo)準(zhǔn)、樣品及樣品加標(biāo)色譜圖

2.4 回收率

在2種樣品中加入已知濃度的2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按照樣品處理步驟處理樣品后進(jìn)樣．根據(jù)色譜圖峰面積計(jì)算2種物質(zhì)的回收率,結(jié)果如表2所示．從表中可以看出,雙氰胺的平均回收率是97.6%,三聚氰胺的平均回收率是96.5%．說(shuō)明HPLC法測(cè)定樣品中雙氰胺和三聚氰胺回收率良好．

3 方法討論

雙氰胺和三聚氰胺均為極性化合物,很難在常用的C18柱上保留．因此,文獻(xiàn)中測(cè)定鹽酸二甲雙胍藥品中的雙氰胺和三聚氰胺所使用的方法為親水相互作用色譜法(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILIC)．但此方法需要使用價(jià)格較為昂貴的特定色譜柱．而本研究中使用常見(jiàn)的ODS C18反相色譜柱,加入離子對(duì)試劑,2種雜質(zhì)在5 min內(nèi)分離完全,保留時(shí)間更短,且檢出限和定量限均低于上述方法,是一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的有效測(cè)定方法．

4 結(jié) 論

本研究建立了一種高效快速的HPLC方法同時(shí)測(cè)定鹽酸二甲雙胍藥品中的雙氰胺和三聚氰胺,2種雜質(zhì)在5 min內(nèi)分離完全．該方法分離效率高,分析時(shí)間短,靈敏度好,樣品處理簡(jiǎn)單快速,是鹽酸二甲雙胍藥品中雜質(zhì)檢測(cè)的一種有效方法．

表2 樣品中CGD和MLN的回收率的測(cè)定(n=3)

注：—為未檢出.

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