王朝元，胡 蝶

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

玉柏石松，又名伸筋草，廣泛分布于湖北、四川、貴州和西藏.在我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥和土家族醫(yī)學(xué)中，玉柏石松被用于治療關(guān)節(jié)炎疼痛、四肢癱瘓、痛經(jīng)和挫傷[1].臨床用于治療骨折，治療效果良好[2,3]，但其治療骨折的藥理學(xué)機制尚不清楚.石松屬植物家族富含生物堿，具有很強的生物學(xué)活性[4].目前已有超過200種生物堿和140種石杉型三萜從石松屬植物中分離出來，具有抗炎、止痛、抗菌等療效[5,6].但這些玉柏石松中化合物促進成骨的研究尚不多見.

課題組前期從玉柏石松中分離來兩個新型四環(huán)三萜類化合物[7]和甾體化合物stigmastan-3-one-21-oic acid (SA)[8].為研究玉柏石松甾體化合物SA (結(jié)構(gòu)式見圖1)誘導(dǎo)骨形成的潛能，本文通過研究SA對成骨細胞毒性、ALP活性、骨基質(zhì)礦化和對骨分化相關(guān)基因(早期成骨分化和礦化相關(guān)基因)的表達的影響，來闡明SA的成骨活性，為進一步開發(fā)利用玉柏石松提供依據(jù).

圖1 豆甾烷-3-酮-21-羧酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of stigmastan-3-one-21-oic acid

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

本實驗所用SA為本實驗室從采自中國湖北省建始縣的玉柏石松中分離純化得到. α-MEM培養(yǎng)基(Thermo賽默飛世爾生化制品有限公司)，小牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜、Alamar Blue、PCR引物(Invitrogen)，Alizarin red S (Sigma-Aldrich)，Trizol、熒光標記試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒(Life Technology, Australia)，礦物油(Sigma Aldrich).

96-孔板(Nunc)，加樣機器人(5075 Eppendorf epMotion)，熒光定量PCR儀(7900HT Fast Real-time system, Applied Biosystems)，酶聯(lián)免疫檢測儀(Optima BMG PolarStar).

1.2 SA提取與純化

本實驗所用的玉柏石松采自中國湖北省建始縣.分離純化過程詳見參考文獻[8].簡言之，將玉柏石松風(fēng)干磨成粉.用MeOH抽提3次，提取物溶解于3%的酒石酸/ H2O(pH=3)中，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物溶于90% 的H2O/MeOH中，依次用石油醚(PE)，EtOAc和nBuOH萃取，將EtOAc 的提取物進行柱層析法(CC)分離，獲9個組分(Fr.1～Fr.9).將Fr.5進行柱層析(硅膠，氯仿/丙酮的體積分數(shù)是1∶0→1∶1)后得到化合物SA.利用核磁共振譜技術(shù)分析化合物A的結(jié)構(gòu)，得到其結(jié)構(gòu)式如圖1所示.

1.3 SA儲存液的配制

1.6×10-3mol/L的SA儲存液配制：將SA溶于二甲基亞砜(DMSO)并渦旋震蕩，60℃加熱30 min溶解，過濾除菌，置于-20℃長期保存.

1.4 細胞培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：用于MC3T3-E1細胞生長，在α-MEM中加入10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/mL鏈霉素.

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：用于分析SA對成骨細胞堿性磷酸酶(ALP)活性，細胞外基質(zhì)礦化，成骨分化相關(guān)基因的表達，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8mol/L地塞米松.

1.5 SA對成骨細胞存活率的影響

用Alamar Blue實驗檢測SA對細胞的毒性.將MC3T3-E1細胞按1×103/孔接種于96孔板中，每孔150 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有5種不同濃度的SA(1,2,4,8,16 μmol/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以1%DMSO為陰性對照，每組設(shè)3個復(fù)孔.將培養(yǎng)板放置于37℃中培養(yǎng)0, 24, 72 h后，每孔加入18 μL的Alamar Blue試劑使其最終體積分數(shù)為10%.用熒光酶標儀于540 nm檢測光吸收值(激發(fā)光544 nm, 發(fā)射光590 nm).

1.6 SA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

將MC3T3-E1細胞按3×104/孔接種于6孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有2種不同濃度的SA(8 μmol/L和16 μmol/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以1%的DMSO為陰性對照，每組設(shè)3個重復(fù)，每3 d換一次培養(yǎng)基.

分別培養(yǎng)8 d和16 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS將細胞洗2次.加入0.1% Triton-X100裂解過夜.用細胞刮刀刮下細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL微量離心管中，4℃、10000 r/min離心10 min.將上清液以每孔100 μL轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔加入200 μL para-Nitrophenylphosphate (pNPP) 顯色劑，在室溫黑暗條件下，輕搖96孔板反應(yīng)30 min，用酶標儀檢測405 nm處的吸光值.每個樣品設(shè)3個重復(fù).

1.7 SA對成骨細胞體外礦化的影響

用茜素紅染色來檢測細胞的礦化.將MC3T3-E1細胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，分別加入含有2種不同濃度的SA(8 μmol/L和16 μmol/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以1%的DMSO為陰性對照，每組設(shè)3個重復(fù).分別培養(yǎng)8 d和16 d后，用PBS將樣品洗2次.室溫條件下，將樣品固定在-20℃冰涼的甲醛上10 min之后，用dH2O洗兩次，加入1%茜素紅孵化，在吸出未結(jié)合的染料后，樣品用dH2O洗若干次后風(fēng)干，用倒置顯微鏡觀察并拍照.

為了定量礦化，每孔中加入800 μL、體積分數(shù)為10%的乙酸.室溫下，搖晃細胞培養(yǎng)板孵化30 min，用細胞刮刀刮下細胞，加入10%的醋酸.渦旋震蕩30 s后，加入200～300 μL礦物油.加熱到85℃，10 min，轉(zhuǎn)移至冰上5 min，20000 r/min離心15 min.取每管上清液300～400 μL轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL的離心管中，加入體積分數(shù)為10%的氫氧化銨200 μL中和酸，取上清液150 μL轉(zhuǎn)移至96孔板中于405 nm檢測吸光值.每個樣品設(shè)3個重復(fù).

1.8 SA對成骨細胞骨分化相關(guān)基因mRNA表達的影響

將MC3T3-E1細胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，加入含有SA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，SA的濃度為8 μmol/L和16 μmol/L，分別培養(yǎng)8 d和16 d，以1%的DMSO為陰性對照，每組設(shè)3個復(fù)孔.用Trizol裂解細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA第一條鏈.熒光定量PCR的引物如表1所示[9], GAPDH為內(nèi)參基因.實驗用384孔板，液體轉(zhuǎn)移后進行熱循環(huán).PCR循環(huán)參數(shù)如下：95℃，10 min；變性：95℃，15 s；退火和延伸：60℃，60 s；循環(huán)數(shù)：45次，每個樣品進行3次.用軟件SDS2.2.2收集數(shù)據(jù)，通過2-ΔΔCT計算藥物對相關(guān)基因表達影響[10].

表1 熒光定量PCR引物序列

ALP: alkaline phosphatase;OPN:osteopontin;OCN:osteocalcin;ColI:collagen I;BSP: bone sialoprotein

1.9 統(tǒng)計分析

用方差分析法對結(jié)果進行顯著性差異分析，p<0.05被認為有顯著性差異，p<0.01被認為有極顯著性差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 SA對成骨細胞增殖的影響

SA對成骨細胞增殖的影響見圖2. Alamar blue試驗顯示：到第3 d，5個濃度的SA對MC3T3-E1細胞的增殖無明顯影響.故選擇2個最高的藥物濃度(8 μmol/L和16 μmol/L)用于進一步實驗.

2.2 對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

SA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響結(jié)果見圖3.與對照組相比，8 μmol/L和16 μmol/L的SA處理細胞8 d后，均能抑制細胞堿性磷酸酶活性.第16 d，SA對成骨細胞堿性磷酸酶活性無顯著影響(p>0.05).

1) 對照組(0 d); 2) 1 d; 3) 3 d與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3圖2 SA對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖的影響Fig.2 The effect of SA on cell viability in vitro

1) control; 2) 8 μmol/L SA; 3) 16 μmol/L SA與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3圖3 SA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響Fig.3 The effect of SA on alkaline phosphatase activity in osteoblasts

2.3 SA對體外成骨細胞基質(zhì)礦化的影響

SA對體外成骨細胞基質(zhì)礦化的影響結(jié)果見圖4.第8 d，對照組和SA處理組細胞都出現(xiàn)鈣化，隨著培養(yǎng)時間的延長，至第16 d，3組細胞均呈現(xiàn)較顯著的體外鈣化.

a) 0 μmol/L; b) 8 μmol/L; c) 16 μmol/L圖4 SA對體外成骨細胞骨基質(zhì)礦化的影響Fig.4 The effect of SA on osteoblast mineralization in vitro

不同濃度的SA對成骨細胞礦化影響如圖5所示.圖5中SA處理細胞16 d后，與對照組相比，8 μmol/L和16 μmol/L SA顯著促進了骨基質(zhì)礦化(p<0.05).

1) control; 2) 8 μmol/L SA; 3) 16 μmol/L SA與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3圖5 不同濃度的SA對成骨細胞礦化影響的定量研究Fig.5 Quantification of mineralization of osteoblasts treated with SA in vitro

2.4 SA對成骨分化相關(guān)基因表達的影響

2.4.1 SA對成骨基質(zhì)蛋白基因mRNA表達的

影響

熒光定量PCR分析成骨細胞關(guān)鍵基因的表達結(jié)果見圖6.圖6a為SA對成骨細胞ALP mRNA表

1) control; 2) 8 μmol/L SA; 3) 16 μmol/L SA與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3a) ALP；b) Col I；c) OPN；d) BSP；e) OCN圖6 SA對成骨細胞骨基質(zhì)形成相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig.6 The effect of SA on the mRNA expression of bone matrix formation-related genes in osteoblasts

達的影響. SA對細胞短時間(8 d)處理抑制了ALP表達；經(jīng)過16 d的培養(yǎng)，8 μmol/L的SA明顯促進了ALP表達，而16 μmol/L的SA對ALP表達有明顯抑制作用(p<0.05).圖6b為SA對成骨細胞ColI mRNA表達的影響.處理細胞8 d，8,16 μmol/L的SA均抑制ColI基因表達(p<0.05)；16 d SA對該基因的表達無明顯影響(p>0.05).圖6c為SA對成骨細胞OPNmRNA表達的影響.處理細胞8 d，8,16 μmol/L SA對OPN表達有明顯促進作用；16 d后，高濃度SA(16 μmol/L)促進OPN的表達(p<0.05).圖6d為SA對成骨細胞BSP mRNA表達的影響.8,16 μmol/L SA在處理細胞8,16 d，均抑制BSP表達(p<0.05).圖6e為SA對成骨細胞OCNmRNA表達的影響(p<0.05).8 μmol/L和16 μmol/L的SA分別處理細胞8 d后，促進了OCN基因表達；但8 μmol/L和16 μmol/L的SA分別處理細胞16 d，OCN表達不受影響(p>0.05).

2.4.2 SA對成骨早期分化相關(guān)基因mRNA表達的影響

Runx-2和Osterix是骨祖母細胞分化成成骨細胞過程中兩個關(guān)鍵基因.圖7顯示SA對成骨早期分化相關(guān)基因mRNA表達的影響.如圖7a 所示，SA處理8 d抑制Runx-2的表達；處理16 d，8 μmol/L的SA對Runx-2的表達有一定促進作用，16 μmol/L的SA則表現(xiàn)出抑制作用.如圖7b所示，SA處理顯著抑制Osterix的表達(p<0.05).

1) control; 2) 8 μmol/L SA; 3) 16 μmol/L SA與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3a) Runx-2; b) Osterix圖7 SA對成骨細胞期成骨細胞分化基因的mRNA表達的影響Fig.7 The effect of SA on the mRNA expression of early osteogenic differentiation genes in osteoblasts

2.4.3 SA對成骨細胞部分轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響

圖8為SA對成骨細胞部分轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響.如圖8a所示，SA處理對c-fosmRNA的表達無任何影響.如圖8b和圖8c所示，SA處理對Jun-D和Fra-2的表達的影響相同：SA處理細胞8 d對Jun-D和Fra-2表達影響甚微；16 d卻顯著促進它們的表達(p<0.05).故SA對Jun-D和Fra-2的mRNA表達影響呈時間依賴性.如圖8d所示，16 μmol/L的SA分別處理顯著提高細胞中Fra-1 mRNA表達量明顯增加；8 μmol/L的SA處理細胞8 d后，F(xiàn)ra-1表達量有所增加，但16 d后，F(xiàn)ra-1的表達量與對照組差不多(p>0.05)，故SA對Fra-1 mRNA的表達呈濃度依賴性.

1) control; 2) 8 μmol/L SA; 3) 16 μmol/L SA與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，n=3a) c-fos; b) Jun-D; c) Fra-2; d) Fra-1圖8 SA對成骨細胞部分轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達的影響Fig.8 The effect of SA on the mRNA expression of transcription factors in osteoblasts

3 討論

在生物體發(fā)育的過程中，骨生成是一個復(fù)雜的過程.首先涉及到MSC細胞分化成為前成骨細胞系.這個過程部分由Runx-2和Osterix這兩個關(guān)鍵基因控制.Runx-2以一個鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合在啟動子上促進相關(guān)基因表達[11].Osterix是MSC向成骨細胞分化的特異因子，僅在正在生長的骨組織中表達[12,13].從干細胞分化到成骨細胞系的形成，Osterix基因表達貫穿了整個過程[12,13].這兩個基因在骨祖母細胞分化成為成骨細胞過程中表達.本研究的結(jié)果表明：SA不利于MSC細胞分化成為前成骨細胞系.緊接著是成骨細胞基質(zhì)形成及礦化階段.成骨細胞形成后，骨基質(zhì)的形成過程包括了骨相關(guān)基因的表達，這些基因包ALP，ColI，OPN，OCN和BSP，骨相關(guān)基因在骨基質(zhì)的形成和骨基質(zhì)鈣化過程中起了重要的作用[14,15].

ALP是早期骨基質(zhì)形成的標志物[16,17].OPN在骨基質(zhì)的礦化和吸收過程中有重要作用.OPN分子富含天冬氨酸的區(qū)域與組織中的羥基磷灰石結(jié)合.OPN在骨折修復(fù)早期的骨重建中具有重要功能，它通過增強骨折斷面舊骨的吸收加快骨折修復(fù)的進程.本研究發(fā)現(xiàn)：SA劑量短期處理可顯著降低成骨細胞中成骨活性的代表性蛋白ALP的活性，顯示其具有抑制骨生成的效果；但茜素紅染色卻顯示出SA促進骨基質(zhì)的礦化，顯示出其具有促進骨生成的能力.同時，SA可顯著促進OPN的表達.說明SA不利于骨折早期骨基質(zhì)的形成，但可通過促進骨折界面的重吸收和后期骨基質(zhì)的鈣化來加速骨折的愈合.

Jun(c-Jun, Jun-B,Jun-D) 和 fos (c-fos, Fra-1, Fra-2 等)蛋白是轉(zhuǎn)錄因子AP1家族成員，在骨礦化階段起著重要作用.AP1在調(diào)節(jié)骨生成和骨重建過程中起重要作用[18].本研究結(jié)果證明：SA在適當(dāng)?shù)臐舛瓤娠@著地促進Jun-D、Fra-1和Fra-2的表達，具有促進骨折愈合過程中骨重建的能力.

4 結(jié)論

SA具有促進骨折愈合的活性，它通過促進轉(zhuǎn)錄因子Jun-D、Fra-1和Fra-2的表達，促進骨折斷面舊骨的吸收和骨基質(zhì)鈣化等,使骨折愈合.

參 考 文 獻

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