彭愛芳，王 珍，李轉(zhuǎn)春，任春雪，范寶莉，劉曉穎，王振英，彭永康

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

大蒜（Allium sativum L.）屬百合科（Liliaceae）蔥屬（Allium），為2年生草本植物.多數(shù)大蒜品種采用無(wú)性繁殖，很難獲得或創(chuàng)造可育的大蒜材料進(jìn)行雜交育種.近年來(lái)，育種工作者搜集了大量的大蒜種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)了可育的大蒜資源并成功進(jìn)行了種子生產(chǎn)，但大蒜實(shí)生種子活力較弱，子代鱗莖大小不同且多是“獨(dú)頭蒜”，嚴(yán)重影響其質(zhì)量和產(chǎn)量，使育種的經(jīng)濟(jì)效益較低[1].目前，大蒜的育種研究主要集中在自然突變或人工誘導(dǎo)突變[2]、體細(xì)胞無(wú)性系變異[3-6]等方面，然而導(dǎo)致大蒜不育的原因目前尚無(wú)定論.

天津?qū)氎娲笏狻傲昙t”為春播大蒜品種，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7].課題組以寶坻大蒜為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)氣生鱗莖的發(fā)育、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的異常行為、花粉粒育性進(jìn)行觀察,并從細(xì)胞學(xué)角度對(duì)大蒜不育的原因作了初步探討.這一研究可為進(jìn)一步開展大蒜的細(xì)胞遺傳及有性雜交育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

寶坻大蒜“六瓣紅”，春天種植于天津師范大學(xué)生物科技園，株距8～10 cm，行距28 cm.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

從大蒜花芽開始分化至花衰老，每天隨機(jī)取5個(gè)花序的10個(gè)花蕾進(jìn)行花發(fā)育的形態(tài)學(xué)觀察.每個(gè)發(fā)育時(shí)期，解剖鏡下對(duì)5朵花進(jìn)行破壞性形態(tài)學(xué)分析[8].

1.2.2 減數(shù)分裂觀察

每天取樣10株，將大小適宜的花蕾置于卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1體積比）中固定，次日轉(zhuǎn)至體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中.在解剖鏡下剝?nèi)∮仔』ɡ僦械男廴?，然后用卡寶品紅染色法制片，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，拍攝花粉母細(xì)胞各時(shí)期的圖像，統(tǒng)計(jì)減數(shù)分裂進(jìn)程中花粉母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常情況的頻率[8-9].

1.2.3 花粉育性鑒定

隨機(jī)取5個(gè)花序的10個(gè)花蕾，將成熟的花藥壓扁后放至培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%的硼酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂）上，25℃暗培養(yǎng)24 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉的發(fā)育.

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜氣生鱗莖的發(fā)育

大蒜氣生鱗莖的發(fā)育過(guò)程如圖1所示.

圖1 大蒜氣生鱗莖的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程Fig.1 Growth and developmental process of aerial bulbs in garlic

大蒜花芽和鱗芽分化期以后，蒜薹開始伸長(zhǎng)，蒜薹先端總苞內(nèi)的花迅速發(fā)育，總苞內(nèi)著生有許多球狀體，即為氣生鱗莖.大蒜種植12周后，總苞內(nèi)長(zhǎng)出氣生鱗莖，為半透明的球狀體，直徑約0.5 mm，如圖1A所示.1周后，蒜薹抽出，氣生鱗莖變?yōu)榘咨?，直徑約1 mm，如圖1B所示.大蒜氣生鱗莖充分吸取光合產(chǎn)物，急速膨大，1個(gè)月后大蒜總苞內(nèi)的氣生鱗莖數(shù)量約有70粒，最大直徑為5 mm，長(zhǎng)度可達(dá)1 cm，如圖1C所示.大蒜總苞內(nèi)有正常形態(tài)的花，由于受氣生鱗莖的擠壓，數(shù)量較少，每株約有8～15朵.

2.2 大蒜花的發(fā)育

大蒜花的發(fā)育過(guò)程如圖2所示.

圖2 大蒜花的發(fā)育Fig.2 Development of garlic flowers

大蒜具有正常形態(tài)的花，但不能結(jié)實(shí)，只能靠播種鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖.種植16周后，花處于閉合狀態(tài)，花藥呈綠色，完全包裹在綠色的花瓣內(nèi)，花蕾長(zhǎng)度為2.5～3.0 mm，花藥長(zhǎng)度不足1.0 mm，如圖2A所示.此時(shí)，花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂期.3 d后，花瓣伸長(zhǎng)，花藥變?yōu)辄S色.花蕾長(zhǎng)度約3 mm，花藥長(zhǎng)度約1 mm，如圖2B所示，花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂完成.大蒜種植17周后，花瓣變成粉紅色，花藥表現(xiàn)出輕微皺縮，花蕾長(zhǎng)度為3.0～4.0 mm，如圖2C所示.2 d后，花瓣變成紫色，花藥皺縮嚴(yán)重，如圖2D所示.隨后，花瓣變成深紫色，花藥完全干枯，如圖2E所示.

2.3 大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程及異常行為

2.3.1 大蒜花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程

大蒜花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程如圖3所示.

減數(shù)分裂由2次細(xì)胞分裂組成，即減數(shù)分裂Ⅰ和減數(shù)分裂Ⅱ.前期Ⅰ的細(xì)線期，染色質(zhì)開始凝集，染色質(zhì)纖維逐漸折疊、螺旋化，密集簇?fù)淼胶说囊贿?，如圖3A所示；偶線期，細(xì)胞核內(nèi)同源染色體聯(lián)會(huì)，染色體開始逐步分散開，同細(xì)線期相比略微變短、增粗，但顏色較淺，如圖3B所示；此時(shí)，由于同源染色體的聯(lián)會(huì)配對(duì)，染色體進(jìn)一步濃縮加粗，顏色加深，減數(shù)分裂進(jìn)入粗線期，如圖3C所示；雙線期，染色體進(jìn)一步螺旋化縮短變粗，配對(duì)的同源染色體彼此排斥并開始分離，但不完全分開，同源染色體的四分體結(jié)構(gòu)清晰可見，如圖3D所示；當(dāng)減數(shù)分裂進(jìn)行至終變期，染色體超螺旋化，形成8個(gè)高度濃縮、形態(tài)較為清晰的二價(jià)體，如圖3E所示；中期Ⅰ時(shí)，核膜、核仁消失，紡錘體形成，染色體高度凝縮，同源染色體整齊地聚集在赤道板上，如圖3F所示；后期Ⅰ，同源染色體對(duì)彼此分離并向兩極移動(dòng)，如圖3G所示；末期Ⅰ，染色體到達(dá)兩極后，逐漸發(fā)生去凝集，染色體周圍核膜重新組裝，形成2個(gè)子細(xì)胞核，同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)也開始分裂，形成2個(gè)間期子細(xì)胞，如圖3H所示.

減數(shù)分裂Ⅰ結(jié)束以后，染色質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)螺旋化縮短、變粗，進(jìn)入前期Ⅱ，如圖3I所示；到了中期Ⅱ，染色體顯著縮短，每個(gè)染色體的著絲點(diǎn)排列在赤道板上，如圖3J所示；后期Ⅱ可觀察到位于赤道板上的姐妹染色單體向細(xì)胞兩極移動(dòng)，如圖3K所示；末期Ⅱ染色體被拉向兩極，染色體又變細(xì)長(zhǎng)，形成4個(gè)圓形的新核，如圖3L所示.隨著細(xì)胞質(zhì)的分裂和新細(xì)胞壁的形成，4個(gè)子細(xì)胞發(fā)育成四分體小孢子.

圖3 大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂不同時(shí)期的染色體特征Fig.3 Chromosome characteristics in different periods of meiosis of pollen mother cell in garlic

2.3.2 大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中的異常行為

大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，染色體結(jié)構(gòu)變異的出現(xiàn)頻率較高，這與同樣以營(yíng)養(yǎng)繁殖為主的百合情況相似[9].本研究中約有27.4%的花粉母細(xì)胞在不同的發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)出各種染色體結(jié)構(gòu)的變異現(xiàn)象，這些變異包括滯后染色體、染色體橋、染色體斷片及微核等.統(tǒng)計(jì)的1 000個(gè)花粉母細(xì)胞中，滯后染色體出現(xiàn)頻率為7.6%，主要存在于中期Ⅰ中，后期Ⅰ和后期Ⅱ有少量出現(xiàn)；染色體橋出現(xiàn)頻率為9.3%，主要是單染色單體橋，極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)2個(gè)染色單體橋；1.7%的細(xì)胞出現(xiàn)染色體斷片，主要出現(xiàn)在后期Ⅰ；微核的出現(xiàn)頻率最高，為9.7%，主要出現(xiàn)在末期Ⅰ和末期Ⅱ.此外，減數(shù)分裂過(guò)程中還有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)染色體不均等分離、多極分裂等異?，F(xiàn)象，共占所統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量的0.7%.

減數(shù)分裂過(guò)程中染色體異常的具體情況如表1和圖4所示.

表1 大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂各時(shí)期染色體異常統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistic of abnormal pollen mother cells in each stage of meiosis in garlic

由表1可知，有3.9%的細(xì)胞在中期Ⅰ時(shí)染色體出現(xiàn)異常，主要表現(xiàn)為滯后染色體，如圖4A所示，這些染色體未和其他染色體同時(shí)到達(dá)赤道板位置，而是游離于赤道板外.在后期Ⅰ時(shí)，有6.1%的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的異常，包括染色體橋、滯后染色體和染色體斷片等異常行為，如圖4B和4C所示，其中出現(xiàn)頻率最高的是染色體橋，主要為單染色單體橋，有些花粉母細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)2種異常，一些染色單體橋會(huì)一直持續(xù)到末期Ⅰ，如圖4D所示.滯后染色體，染色體斷片在末期Ⅰ時(shí)形成微核，研究中觀察到大量細(xì)胞出現(xiàn)微核，如圖4E所示.后期Ⅱ中，有4.5%的花粉母細(xì)胞出現(xiàn)異常行為，表現(xiàn)出染色體滯后和染色體橋現(xiàn)象，如圖4F和4G所示.末期Ⅱ時(shí)，仍然存在染色體橋，大量細(xì)胞出現(xiàn)微核現(xiàn)象，如圖4H所示，這一時(shí)期，出現(xiàn)異常細(xì)胞的頻率為6.3%.

圖4 大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象Fig.4 Abnormal meiosis of pollen mother cells in garlic

2.4 大蒜花粉的育性

觀察寶坻大蒜的花藥，發(fā)現(xiàn)適宜環(huán)境下，花粉粒未萌發(fā)出花粉管，如圖5所示.這證明大蒜花粉粒沒有育性.

圖5 大蒜花粉粒萌發(fā)情況Fig.5 Germination of pollen in garlic

3 討論與結(jié)論

寶坻大蒜具有正常形態(tài)的花，總苞內(nèi)氣生鱗莖數(shù)量多，長(zhǎng)勢(shì)快，由于受氣生鱗莖的擠壓，總苞內(nèi)花的數(shù)量很少，僅有8～15朵.當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為2.5～3.0 mm，花藥長(zhǎng)度不足1 mm時(shí)，花藥呈綠色，可初步判斷花粉母細(xì)胞處于減數(shù)分裂旺盛期，可以此作為取材依據(jù).大蒜花藥形態(tài)看似正常，但花粉未表現(xiàn)出育性.氣生鱗莖急劇膨大對(duì)養(yǎng)分爭(zhēng)奪強(qiáng)烈，致使花藥在花期到來(lái)之前就全部干枯.

本研究通過(guò)觀察大蒜花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程，發(fā)現(xiàn)27.4%的花粉母細(xì)胞中出現(xiàn)滯后染色體、染色體橋、染色體斷片和微核等異?，F(xiàn)象.大蒜花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、后期Ⅱ和末期Ⅱ均有異常行為出現(xiàn).中期Ⅰ主要是同源染色體的滯后，未和其他二價(jià)體同時(shí)到達(dá)赤道板位置，可能隨機(jī)分離或落后于其他二價(jià)體，末期時(shí)會(huì)形成微核[8]；后期Ⅰ和后期Ⅱ，染色體異常細(xì)胞數(shù)量較多，多表現(xiàn)為滯后染色體、染色體橋和染色體斷片，有少量細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)2種異常.染色體橋是減數(shù)分裂最常見的異常行為，可以作為鑒定染色體臂內(nèi)是否出現(xiàn)倒位的依據(jù)之一.在后期Ⅰ和后期Ⅱ均觀察到染色體單體橋，有些染色體橋會(huì)一直持續(xù)到末期，這類橋在倒位環(huán)內(nèi)只有一次交換，倒位的一個(gè)遺傳學(xué)效應(yīng)是降低配子的育性，產(chǎn)生不均衡配子，導(dǎo)致配子不育.滯后染色體和染色體斷片進(jìn)入末期，會(huì)形成微核，減數(shù)分裂末期Ⅰ、末期Ⅱ觀察到大量微核.除以上這些異常之外，減數(shù)分裂過(guò)程中還有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)染色體不均等分離、多級(jí)分裂異常現(xiàn)象.微核、不均等分離、多極分裂均可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的減少或增加，產(chǎn)生不育配子[9-10].

細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程受一些基因嚴(yán)格控制，其中任何一個(gè)基因發(fā)生突變，都會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂過(guò)程出現(xiàn)異常.大蒜長(zhǎng)期進(jìn)行無(wú)性繁殖，導(dǎo)致病毒的傳遞與積累，影響細(xì)胞內(nèi)的生理、生化過(guò)程，誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異，進(jìn)而影響花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的正常進(jìn)行[8-9].

導(dǎo)致大蒜不育的原因目前尚無(wú)定論.Pooler等[11]和Jenderek[12]認(rèn)為發(fā)育中的花不能與氣生鱗莖競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果導(dǎo)致了花粉的不育[13].本研究通過(guò)觀察氣生鱗莖和花器官的發(fā)育，發(fā)現(xiàn)由于開花期間氣生鱗莖急劇膨大，受其擠壓和對(duì)養(yǎng)分的爭(zhēng)奪，發(fā)育中的花不能與氣生鱗莖競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，致使花藥中途干枯，因此認(rèn)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏可能是導(dǎo)致花粉不育的原因之一.Etoh[14]和Simon等[15]認(rèn)為最根本的原因是染色體異常，他們觀察到SAT染色體上缺少許多隨體，因此推測(cè)大蒜染色體異?；蛉笔Вm能正常進(jìn)行減數(shù)分裂，但小孢子退化，雙核花粉失去活力.花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常與花粉育性的相關(guān)性已經(jīng)在百合（Lilium L.）[9]、毛車前（Plantago virginica L.）[16]、向日葵（Helianthus annuus L.）[17]等多種植物的研究中得到證實(shí).本課題組通過(guò)研究大蒜花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程，發(fā)現(xiàn)存在滯后染色體、染色體橋、染色體斷片和微核等異常現(xiàn)象，初步認(rèn)為這些異常可能是導(dǎo)致大蒜花粉不育的重要原因之一.

[1]劉冰江，張海燕，孔素萍，等.大蒜有性生殖研究進(jìn)展[J].中國(guó)蔬菜，2008（8）：41-44.

[2]XU P W，SUN H S，YANG Y J，et al.A primary study on mutation induction of in vitro cultured garlic shoots by60Coγ-ray irradiation[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，1999，13（3）：142-146.

[3]馮志杰.植物體細(xì)胞無(wú)性系變異發(fā)生的遺傳機(jī)理[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1993，1（1）：8-17.

[4]LOPEZ F A，RIGONI C，SILVESTRI V，et al.Genetic variability estimation and correlations in white clonal type garlic（Allium sativum L.）characters[J].Acta Horticulturae，1997（433）：279-284.

[5]DHOOGHE E，VAN LAERE K，EECKHAUT T，et al.Mitotic chromosome doubling of plant tissues in vitro[J].Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，104（3）：359-373.

[6]EINAT S M，KRYSTYNA W，LIDIA B，et al.Male gametogenesis and sterility in garlic（Allium sativum L.）：barriers on the way to fertilization and seed production[J].Planta，2013（237）：103-120.

[7]張澤明，楊連志，劉佐.寶坻縣大蒜資源調(diào)查[J].天津農(nóng)林科技，1994，128（2）：39-41.

[8]李萬(wàn)昌，王靜，郭士偉，等.水稻亞種間雜種F1半不育小孢子發(fā)生的細(xì)胞學(xué)觀察[J].西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（1）：7-10.

[9]張彩霞，明軍，劉春.百合花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象觀測(cè)分析[J].生物學(xué)通報(bào)，2010，45（5）：45-48.

[10]FUGE H.Fine structure of anaphase bridges in meiotic chromosomes of the crane fly Pales[J].Chromosoma（Berl），1978，65：241-246.

[11]POOLER M R，SIMON P W.True seed production in garlic[J].Sexual Plant Reprod，1994，7：282-286.

[12]JENDEREK M M.Generative reproduction of garlic（Allium sativum）[J].Sesja Naukowa，1998，57：141-145.

[13]劉冰江，張海燕，徐培文.大蒜有性生殖研究進(jìn)展[J].中國(guó)蔬菜，2008（8）：41-44.

[14]ETOH T.Studies on the sterility in garlic（Allium sativum）[J].Mem Fac Agr Kagoshima Univ，1985，21：77-132.

[15]SIMON P W，JENDEREK M M.Flowering，seed production，and the genesis of garlic breeding[J].Plant Breeding Reviews，2003，23：211-244.

[16]張書芹，王俊杰，史大聰，等.毛車前的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及核型分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（6）：124-127.

[17]ATLAGIC J，DOZET B，SKORIC D.Meiosis and pollen grain viability in Helianthus mollis，Helianthus salicifolius，Helianthus maximiliani and their F1hybrids with cultivated sunflower[J].Euphytica，1995，81：259-263.