任海峰，趙英魁，楊 峰，俞 媛，馬志強 (第二軍醫(yī)大學藥學院，上海 200433)

微小RNA(microRNA，miRNA)是由內源性發(fā)夾(hairpin)結構轉錄衍生而來的一種長度為19～25 nt的單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)，廣泛存在于真核生物細胞中，是一種非編碼RNA，它可以介導基因沉默[1]。近年來，越來越多的證據(jù)顯示miRNA在生理過程中起到很大的作用[2]，它們的異常表達會導致很多疾病的發(fā)生[3，4]。因此，近年來不少科學家試圖利用miRNA的生理功能實現(xiàn)疾病治療的目的[5，6]。但是，裸miRNA通過注射等方式進入機體存在諸多問題，包括：在血清中穩(wěn)定性差，很快被細胞外的RNA酶降解；在正常組織中會有非特異性分布，從而使它們在靶組織的水平降低，發(fā)揮不了期望的藥理活性[7]。因此，將miRNA成功地導入體內，有效地到達靶組織，迫切需要尋找一種高效的載體來克服上述障礙。

目前常用的兩種基因載體：病毒載體和非病毒載體。病毒載體雖然有極高的轉染效率，但是其轉基因表達時間短，不能在宿主細胞中持續(xù)表達，臨床上也存在多種安全問題[7-10]，因此病毒載體的應用前景備受質疑。為了解決病毒載體出現(xiàn)的問題，大量的非病毒載體被開發(fā)出來用于基因傳遞，例如殼聚糖、陽離子脂質體以及陽離子高分子嵌段聚合物等。在諸多非病毒載體中，具有質子海綿效應的聚陽離子高分子材料日益受到重視，有望成為解決基因傳遞問題的重要材料。該類材料可以增強復合物粒子在血液中的穩(wěn)定性，避開網狀內皮系統(tǒng)(reticuloendothelial system ,RES)的吞噬作用，具有良好的內涵體逃逸功能，同時兼具較低的細胞毒性，是一種理想的基因載體。

聚賴氨酸是近年來應用較廣泛的一種陽離子載體，極具應用前景。在質粒DNA以及siRNA(small interfering RNA)的傳遞系統(tǒng)中多有報道[11-13]，但是尚未見該材料用于miRNA的基因傳遞系統(tǒng)中。hsa-miR-15a是一種典型的miRNA, 在多種腫瘤中該基因缺失或者下調。本實驗合成了PEG化的聚賴氨酸，并以hsa-miR-15a為模型基因探討PEG化的聚賴氨酸包覆miRNA的性能，對其細胞毒性進行考察，實驗結果表明PEG-b-PLL是一種有潛力的miRNA基因傳遞載體。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1試劑 甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2)和N-碳芐氧基賴氨酸(Nepsilon-Cbz-L-Lysine)購于上海阿拉丁試劑有限公司；二亞乙基三胺(DET)購自百靈威科技有限公司；Goldview核酸染料，購自北京賽百盛基因技術有限公司；CKK-8試劑盒，購自同仁化學研究所；其余有機溶劑與反應介質購自國藥集團。

1.1.2儀器 核磁共振儀(美國Bruker公司)；冷凍干燥機V55C型(美國Virtis公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Barnstead公司)；電泳儀WH-300-LCD(上海伊瑞生物科技儀器有限公司)；水平電泳槽YR-158(上海伊瑞生物科技有限公司)；凝膠成像儀(上海復日科技有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1PEG-b-PLL的合成

圖1 PEG-b-PLL合成示意圖

稱取N-碳芐氧基氨酸10 g，溶于回流過的四氫呋喃50 ml,升溫至60℃，在磁力攪拌下加入三光氣7 g，待反應液變成澄清后充入氮氣去除多余的光氣和HCl氣體，旋蒸濃縮反應液，用氯仿稀釋，并緩慢加入過量正己烷沉淀產物，在冰箱中靜置12 h，過濾得粗產物，并用乙酸乙酯-正己烷(1:1)重結晶，靜置12 h，過濾，真空干燥得產物L-碳芐氧基賴氨酸-N-羧酸酐。

精密稱取PEG-NH2500 mg、L-碳芐氧基賴氨酸-N-羧酸酐2.5 g，溶于6.2 ml的DMF(二甲基甲酰胺)中，氮氣保護，體系隔絕水，在35 ℃條件下反應72 h，用純水透析，即得PEG-b-PLL-Cbz。

取PEG-b-PLL-Cbz 500 mg，加入10 ml混合溶劑HBr-HAc(1:2), 再加入2 ml TFA(三氟乙酸)，室溫下反應72 h，加入過量乙醚沉淀分層，取水相，加入堿調至弱酸，透析，加入過量乙醚，沉淀，加入水靜置分層，除去乙醚層，加堿中和，透析，凍干，得終產品。

1.2.2聚復合物的合成及表征 采用自組裝法合成聚復合物。按照N/P=0,5,10,20，取PEG-b-PLL和hsa-miR-15a在10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)中，按照一定比例混合孵育，自組裝得到載基因聚復合物(hsa-miR-15a-polyplex)。將hsa-miR-15a-polyplex稀釋于0.001 mol/L NaCl溶液中，測定光散射粒徑、PDI、Zeta電位值。

同時，為了考察該膠束復合物的性質隨時間變化的趨勢，選定N/P=20的情況對各組膠束復合物的粒徑和PDI在10%FBS(胎牛血清)的PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液中考察，每半小時測定一次，直到最穩(wěn)定組的粒徑和PDI發(fā)生凝聚后1 h停止記錄。

用4% 瓊脂糖凝膠電泳檢測聚復合物對miRNA的包封率。稱取瓊脂糖4 g，加入87 ml無菌蒸餾水，微波爐中加熱溶解，加入10 ml RNArun溶液，室溫下將溶液冷卻至60 ℃左右，再加入3 ml去離子甲醛，混勻，趁熱灌膠，上樣前用110 V電壓預電泳5 min。

1.2.3聚復合物細胞毒性的研究 培養(yǎng)的慢性淋巴白血病細胞(K562細胞)，采用CKK-8試劑盒測定考察PEG-b-PLL的細胞毒性。實驗步驟如下：

1.2.3.1取出對數(shù)生長期的K562細胞，吹勻，1 500 r/min離心5 min,棄去培養(yǎng)基，收集K562細胞，重懸接種于96孔板，每孔加細胞懸液90 μl，濃度為1×104cell/well。加入不同濃度的合成聚合物溶液，混合均勻，于37℃、5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)4 h。設計每個濃度3個復孔。同時設不加細胞的空白孔和不進行任何處理的陰性對照孔。

1.2.3.2各因素組細胞孵育2 d后，取出96孔板，每孔加入15 μl的CCK-8溶液，將孔板置于孵箱中繼續(xù)孵育4 h。

1.2.3.3用紫外酶標儀測定在450 nm處的吸光度值。

1.2.3.4計算每組3個復孔的平均吸光度值(OD值)，按以下公式計算細胞生存率：

細胞生存率(%)=(樣品OD值-空白OD值)/(陰性對照OD值-空白組OD值)×100%

2 結果

2.1PEG-b-PLL的合成 設計聚賴氨酸的聚合度為80，合成的產品核磁譜如圖1，以分子中PEG定標的情況下得出芐基的個數(shù)為82.7個，即所得產品賴氨酸聚合度約為83。PEG-b-PLL-Cbz在脫掉芐基后即生成PEG-b-PLL。

圖1 PEG-b-PLL-Cbz核磁圖譜

2.2聚復合物的合成及表征 實驗結果如表1， 結果顯示隨著N/P(氮磷比)的增大，miRNA由游離狀態(tài)逐漸與高分子材料復合，形成膠束復合物，膠束復合物的納米粒比較松散，粒徑在150～260 nm之間?？赡芤驗閙iRNA的鏈段很短(只有21個堿基對)，并且剛性很強的緣故，因此在我們的實驗里， 并未見到膠束的粒徑與 N/P有明顯的線性關系。PDI(多分散性)可衡量膠束復合物粒徑的分散程度，通常認為在膠束復合物系統(tǒng)中，PDI<0.3方可滿足進一步研究的要求。我們制備的膠束復合物的PDI均在0.3以下，并且膠束復合物整體帶正電荷(Zata電位都在10 mV以上),滿足后續(xù)實驗通過與細胞膜的負電荷物質(主要為磷脂雙分子層)相互作用，內吞進入細胞的要求。

表1 不同氮磷比下膠束復合物的動態(tài)光散射數(shù)據(jù)

中性溶液中，帶有負電荷的miRNA可利用甲醛變性瓊脂糖從負極向正極泳動，利用Goldview核酸染料插入到miRNA后在紫外燈下呈現(xiàn)熒光條帶。凝膠電泳阻滯分析法可以通過熒光的位置和強度直觀地反映聚合物與RNA結合作用的強弱。當聚合物與miRNA結合牢固時，紫外燈下無法觀察到熒光；如果結合得不牢固，那么游離的miRNA就會與核酸染料結合顯示出熒光。如圖2所示，當N/P=0時，裸的miRNA顯示出非常強的熒光，隨著N/P的增大，熒光逐漸減弱，并且拖尾現(xiàn)象消失，顯示miRNA已經與PEG-b-PLL穩(wěn)定結合形成膠束復合物，滯留在加樣孔中。

圖2 不同N/P條件下，高分子嵌段共聚物對于miRNA的復合效率(圖中0～5為復合物中的N/P，即氮磷比)

為了測定該膠束復合物在生理條件下的穩(wěn)定性，在0.1 mol/L PBS的溶液體系中制備N/P=10，基因濃度在5 nmol/L的膠束復合物溶液，每隔2 h測一次其粒徑和PDI變化(圖3)?？梢钥闯觯胶蚉DI的變化是比較一致的。隨著時間的推移，復合物的粒徑逐漸增大，由160 nm左右增至1 000 nm以上，伴隨的是PDI的數(shù)值由0.2左右逐漸增大到0.45左右，表明隨著時間的推移，膠束復合物的穩(wěn)定性逐漸下降，膠束復合物在溶液電解質的作用下，在20 h后明顯發(fā)生團聚現(xiàn)象。

圖3 N/P=10時，膠束復合物的粒徑和PDI隨時間變化趨勢

2.3聚復合物細胞毒性的研究 實驗所得結果如圖4，分別在PEG-b-PLL的濃度為0.04、0.2、1 mg/ml時測定其毒性。由實驗結果我們可以看出，在相同濃度下，相對傳統(tǒng)的轉染試劑PEI,膠束復合物的細胞存活率遠高于PEI組；同已經商業(yè)化的lipo2000比較，只有高分子材料在1 mg/ml的高濃度時毒性高于lipo2000，而在接近工作濃度的0.04 mg/ml，高分子材料的表現(xiàn)略優(yōu)于lip2000。表明該材料可作為基因載體做進一步的研究。

圖4 不同濃度下，PEG-b-PLL的細胞毒性(賴：PEG-b-PLL)

3 討論

因為miRNA較質粒DNA和siRNA脆弱，因此在載體系統(tǒng)的設計中能保證其穩(wěn)定性就顯得十分重要。在本實驗中成功制得PEG-b-PLL，核磁譜顯示聚賴氨酸聚合度83，與實驗設計的結構接近，說明本合成方案可行。利用動態(tài)光散射對不同N/P條件下膠束復合物的流體力學半徑以及Zeta電位進行研究，實驗結果表明，隨著N/P的增大，膠束復合物的流體力學半徑變小，Zeta電位變化不大，表明可能在此過程中，膠束復合物復合miRNA的能力逐漸增大。本實驗還利用凝膠阻滯色譜測定了膠束復合物復合miRNA的能力，在N/P≥5時，聚合物可以對miRNA進行有效包覆；動態(tài)光散射數(shù)據(jù)顯示，在N/P=10時，在20 h后膠束復合物開始發(fā)生聚沉現(xiàn)象，顯示膠束復合物在類生理環(huán)境下具有一定的穩(wěn)定性。最后對該高分子材料的細胞生物毒性進行了考察，結果顯示聚賴氨酸-miRNA聚復合物各項特性符合應用要求，相比其他載體毒性低，極具應用前景。該材料有望通過傳遞miRNA進入細胞內，在腫瘤治療等領域發(fā)揮巨大作用。

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