趙曉暉， 蘆麗莉， 葛 賀， 李 冰， 趙雪儉， 劉艷波△

(1北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心，吉林 長(zhǎng)春 132001)

前列腺癌(prostate cancer，pCa)是美國(guó)男性癌癥死亡的第二大原因，2010年，估計(jì)美國(guó)有217 030例前列腺癌患者被確診，約32 050人死于該病[1]。目前我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也呈逐漸增加趨勢(shì)。pCa具有侵襲性及耐藥性特點(diǎn)[2]，而前列腺癌根治術(shù)并發(fā)癥較多，對(duì)轉(zhuǎn)移的前列腺癌幾乎無(wú)作用[3]。存活蛋白(survivin)是1997年確定的一種凋亡抑制蛋白，能抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)，有研究證實(shí)survivin表達(dá)在前列腺癌中異常升高。GRIM-19蛋白是GRIM家族的一個(gè)新成員，為一種新的腫瘤抑制蛋白。研究表明，GRIM-19在許多正常組織中高表達(dá)，但在多種癌癥中低表達(dá)或沒(méi)有表達(dá)，有研究證實(shí)在人前列腺癌組織中GRIM-19表達(dá)缺失。另一方面，GRIM-19可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)干擾素β聯(lián)合維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)獲得自身死亡活化[4]。本研究在前期工作成功構(gòu)建pGRIM-19-si-survivin 共表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，以減毒沙門(mén)菌作為運(yùn)載體，觀察其對(duì)裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑瘤效應(yīng)，并探討相關(guān)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

雄性裸鼠，30只，4～6周齡，質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。

2 主要材料

psi-survivin質(zhì)粒、psi-scramble質(zhì)粒、pGRIM-19質(zhì)粒、pGRIM-19-si-survivin重組質(zhì)粒和DU145細(xì)胞株由吉林大學(xué)前列腺疾病防治研究中心饋贈(zèng)；減毒人傷寒沙門(mén)氏菌Ty21a由美國(guó)馬里蘭大學(xué)胡嘉娣教授饋贈(zèng)；JM109大腸桿菌由本研究室保存；兔抗人survivin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；鼠抗人Ki67單克隆抗體購(gòu)自Abcom；二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉試劑公司；Trizol試劑為Invitrogen;TUNEL試劑盒購(gòu)于南京建成生物試劑公司；引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司完成。

3 方法

3.1重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化減毒人傷寒沙門(mén)氏菌 分別將psi-scramble、psi-survivin、pGRIM-19和PGRIM-19-si-survivin質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人減毒沙門(mén)菌Ty21a。

3.2裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的構(gòu)建及治療 將DU-145細(xì)胞調(diào)整到2.5×1010cells/L，取0.2 mL接種于裸鼠左側(cè)背部皮下。20 d后，在無(wú)菌條件下取出瘤組織塊，將瘤組織分成直徑約2 mm的瘤塊植入另外30只裸鼠皮下。待移植瘤長(zhǎng)至直徑約7 mm時(shí)將裸鼠隨機(jī)分為6組，即mock組(PBS作為對(duì)照)、單純減毒沙門(mén)氏菌組、沙門(mén)菌攜帶的psi-scramble組、psi-survivin組、pGRIM-19組和pGRIM-19-si-survivin治療組，每組5只動(dòng)物，裸鼠腹腔注射含有上述質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌20 μL (108cfu/100 μL)，每周2次監(jiān)測(cè)裸鼠皮下移植瘤體積，直至70 d處死。裸鼠體積按以下公式進(jìn)行計(jì)算：V=L×W2×0.52，L為腫瘤的長(zhǎng)徑，W為腫瘤的短徑。繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線并計(jì)算抑瘤率(inhibitory rate，IR)，IR(%)=(1-治療組瘤重/對(duì)照組瘤重)×100%。

3.3病理學(xué)檢查及免疫組織化學(xué)染色 取10%甲醛固定后的組織，石蠟包埋，組織切片4 μm，進(jìn)行HE染色，各種動(dòng)物腫瘤組織進(jìn)行survivin、GRIM-19和Ki67的免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察，拍照并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4腫瘤組織相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá) 利用Trizol試劑提取pCa移植瘤組織內(nèi)總RNA，RT-PCR擴(kuò)增survivin、GRIM-19、 caspase-3、Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1、VEGF和內(nèi)參照β-actin,引物序列與參考文獻(xiàn)[5]相同。

3.5TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟入水，新鮮配制的3% H2O2室溫處理10 min，PBS洗3 min×3次，組織用胰蛋白酶37 ℃水浴消化30 min，PBS洗3 min×3次，加TUNEL檢測(cè)液，每片50 μL，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗3 min×3次，滴加 DAB顯色，PBS洗3 min×3次，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。每個(gè)切片觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野連續(xù)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分比即為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±SEM) 表示，SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，用Excel作圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒對(duì)裸鼠前列腺癌皮下移植瘤的抑制作用

DU145細(xì)胞接種裸鼠皮下2周后，可見(jiàn)裸鼠前列腺癌移植瘤模型復(fù)制成功。隨后將移植塊接種裸鼠皮下，連續(xù)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1、2。從第15天開(kāi)始腹腔注射攜帶不同質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。從第35天開(kāi)始，共表達(dá)質(zhì)粒組與對(duì)照組及單基因質(zhì)粒組相比，腫瘤體積開(kāi)始明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；70 d 處死動(dòng)物時(shí)，攜帶共表達(dá)質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌組其腫瘤體積為(284.33±57.33) mm3，攜帶psi-survivin組腫瘤體積為(671.36±165.11)mm3，攜帶pGRIM-19組減毒沙門(mén)菌腫瘤體積為(857.29±170.07)mm3，前者與后兩者比較，腫瘤體積分別減少2.36和3.02倍，治療效果明顯(P<0.05)。

Figure 1. Intraperitoneal injection of S. typhi carrying pGRIM-19, psi-survivin and pGRIM-19-si-survivin plasmids resulted in significant inhibition of DU145 tumor growth in vivo. A: mock; B: S. typhi; C: psi-scramble; D: pGRIM-19; E: psi-survivin; F: pGRIM-19-si-survivin.

Figure 2. Growth curves of DU145 xenografts treated with recombinant plasmids.Arrows: plasmid treatment.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05 vs pGRIM-19 or psi-survivin.

2 腫瘤組織survivin和GRIM-19的蛋白免疫組化檢測(cè)

由圖 3 可見(jiàn)，GRIM-19蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿，少部分表達(dá)于胞核。圖4表明survivin蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞漿，顯棕黃色，也有部分位于胞核內(nèi)。攜帶pGRIM-19-si-survivin沙門(mén)菌治療組腫瘤細(xì)胞內(nèi)survivin表達(dá)明顯低于攜帶psi-scramble減毒沙門(mén)菌治療組；而GRIM-19的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，從而說(shuō)明攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒減毒沙門(mén)菌可有效提高腫瘤組織內(nèi)GRIM-19蛋白含量，同時(shí)降低survivin蛋白的表達(dá)。

3 腫瘤組織Ki67免疫組化染色

如圖5所示，攜帶psi-scramble減毒沙門(mén)菌治療組Ki67表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，顯棕黃色，攜帶psi-survivin和pGRIM-19質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌治療組Ki67表達(dá)不同程度減弱，而攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒減毒沙門(mén)菌組減弱更明顯(P<0.05或P<0.01)。

Figure 3. Immunohistochemical analysis of GRIM-19 expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying psi-scramble and pGRIM-19-si-survivin plasmids(×400).

Figure 4. Immunohistochemical analysis of survivin expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying psi-scramble and pGRIM-19-si-survivin plasmids(×400). Arrows indicate the positive cells with yellow color.

Figure 5. Immunohistochemical analysis of Ki67 expression in DU145 xenografts treated with S. typhi carrying diffe-rent plasmids (×400).Arrows indicate the positive cells with yellow color.

4 腫瘤組織GRIM-19和survivin mRNA表達(dá)分析

RT-PCR顯示(圖6)，survivin mRNA表達(dá)在mock組、攜帶psi-scramble減毒沙門(mén)菌組和單純減毒沙門(mén)菌組無(wú)顯著差異(P>0.05)；而攜帶psi-survivin減毒沙門(mén)菌治療組、pGRIM-19減毒沙門(mén)菌治療組和pGRIM-19-si-survivin減毒沙門(mén)菌治療組survivin mRNA表達(dá)減弱，以共表達(dá)質(zhì)粒組降低最明顯(P<0.05)。而GRIM-19 mRNA在mock組、攜帶psi-scramble減毒沙門(mén)菌組和單純減毒沙門(mén)菌組表達(dá)基本缺失，攜帶pGRIM-19及共表達(dá)質(zhì)粒組GRIM-19 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。

Figure 6. RT-PCR analysis of survivin and GRIM-19 mRNA in DU145 xenografts.Mean±SEM.n=3.*P<0.05 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05 vs psi-survivin or pGRIM-19.

5 RT-PCR 檢測(cè)腫瘤組織相關(guān)蛋白(caspase-3、Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF)的mRNA表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖7)，與其它單基因?qū)φ战M比較，攜帶共表達(dá)質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌可明顯抑制腫瘤組織中Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF mRNA表達(dá)，但同時(shí)增強(qiáng)caspase-3的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)。

6 腫瘤組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

TUNEL結(jié)果顯示，mock組動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)鮮見(jiàn)凋亡細(xì)胞，而攜帶psi-survivin、pGRIM-19和pGRIM-19-si-survivin不同質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌組可見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，以pGRIM-19-si-survivin組細(xì)胞凋亡更明顯。如圖8所見(jiàn)，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核固縮濃染，形狀不規(guī)則，并呈現(xiàn)棕黃色染色，與單基因治療組比較，差異顯著(P<0.05)。

Figure 7. The mRNA expression of apoptosis-related proteins caspase-3, Bcl-xL, c-Myc, Stat3, cyclin D1 and VEGF in the DU145 xenografts after intraperitoneal injection of recombinant bacteria carrying different plasmids.Mean±SEM.n=3.*P<0.05, ** P<0.01 vs control (mock, S.typhi or psi-scramble); #P<0.05,##P<0.01 vs psi-survivin or pGRIM-19.

討 論

腫瘤的發(fā)生是由多個(gè)基因共同調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。腫瘤治療最理想的方法是殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)盡量降低對(duì)正常細(xì)胞的損傷，通過(guò)基因治療方法可更準(zhǔn)確地作用于癌細(xì)胞。腫瘤內(nèi)部的缺氧環(huán)境是抵抗放化療的重要原因。減毒的沙門(mén)菌兼性厭氧生長(zhǎng)，它作為基因運(yùn)載體具有靶向傳遞目的基因的特點(diǎn)，可選擇性地在腫瘤組織中復(fù)制、表達(dá)編碼治療性蛋白效應(yīng)基因等[6-7]。本文研究以減毒沙門(mén)菌為載體，攜帶si-survivin與GRIM-19共表達(dá)質(zhì)粒對(duì)pCa進(jìn)行治療。結(jié)果證實(shí)，減毒沙門(mén)菌本身在腫瘤早期階段具有一定的抗癌效果，與其增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的活性有關(guān)。但攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒的減毒沙門(mén)菌與單一基因治療組相比，腫瘤體積縮小更加明顯，通過(guò)免疫組化染色、RT-PCR等法檢測(cè)survivin表達(dá)被明顯抑制而GRIM-19表達(dá)上調(diào)，與體外的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[8]，說(shuō)明沙門(mén)菌可將攜帶的目的基因成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮相應(yīng)的作用。眾所周知survivin是凋亡抑制蛋白家族中非常重要的成員，Lim等[4]研究表明，survivin與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)，其主要通過(guò)抑制caspase活性阻斷細(xì)胞凋亡過(guò)程[9]。而干擾素β和維甲酸聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡基因GRIM-19是新的抑癌基因，它能和Stat3反式激活結(jié)構(gòu)域組合，抑制Stat3活性進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)分化及凋亡過(guò)程[10]。Stat3沉默可使其下游如Bcl-2、Bcl-xL、cyclin D1、survivin和VEGF表達(dá)下調(diào)，p53和caspases表達(dá)上調(diào)，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，其發(fā)生機(jī)制與細(xì)胞周期改變、細(xì)胞凋亡激活及抑制細(xì)胞增殖關(guān)系密切。因此本研究檢測(cè)了Bcl-xL、c-Myc、Stat3、cyclin D1和VEGF表達(dá)變化，為探討其相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

Figure 8. Apoptosis in the DU145 xenografts after intraperioneal injection of recombinant bacteria carrying varions plasmids detected by TUNEL assay (×400).Arrows indicate the TUNEL-positive cells.

本研究運(yùn)用RT-PCR對(duì)Bcl-xL表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果證實(shí)與單基因治療組比較pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒抑制Bcl-xL表達(dá)的功能更強(qiáng)，雖然Bcl-xL與survivin呈相關(guān)性，但具體作用途徑不明確。c-myc基因是一種原癌基因，被激活后使細(xì)胞分裂加速，增殖加快，細(xì)胞甚至獲得永生化。c-Myc參與細(xì)胞凋亡，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11]，因?yàn)閏-Myc通過(guò)JAK/Stat3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程[12]。本研究表明， pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒組與單基因組相比較c-Myc表達(dá)明顯減弱，且pGRIM-19組低于psi-survivin組，說(shuō)明GRIM-19直接使Stat3沉默，抑制c-Myc的激活，而survivin反向調(diào)節(jié)Stat3的作用很弱。Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，Stat3抑制劑可抑制cyclin D1啟動(dòng)子活性并使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯[13]。本實(shí)驗(yàn)在RT-PCR中檢測(cè)到pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒組cyclin D1表達(dá)比單基因組低。VEGF是腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素之一，對(duì)維持腫瘤細(xì)胞氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)具有重要意義。阻斷VEGF表達(dá)，可減少腫瘤組織內(nèi)血管生成及血液供應(yīng)，對(duì)治療腫瘤具有重要意義[14]。VEGF在腫瘤組織周圍高表達(dá)不但直接促使新生血管生成，而且還可誘導(dǎo)survivin表達(dá)，產(chǎn)生抗凋亡效應(yīng)，VEGF又依賴于survivin，兩者相互影響，共同促進(jìn)癌癥的發(fā)生及發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，與單基因治療組比較,pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒明顯抑制VEGF表達(dá)，說(shuō)明共表達(dá)基因可以通過(guò)GRIM-19對(duì)Stat3的作用控制VEGF，也可以通過(guò)survivin與VEGF的相關(guān)性來(lái)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)Stat3和caspase-3的表達(dá)變化，從結(jié)果看出pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒明顯抑制Stat3表達(dá)但促進(jìn)caspase-3的表達(dá)。

為了驗(yàn)證pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療腫瘤目的，本研究利用TUNEL染色法觀察了不同細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果證實(shí)與單基因治療組比較共表達(dá)質(zhì)粒組促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用更明顯，凋亡率明顯增加，凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核固縮，染色質(zhì)凝集等特點(diǎn)。從而也說(shuō)明了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控不是單一因素作用的，而是多因素共同作用的結(jié)果，單獨(dú)解決某個(gè)異常高表達(dá)的基因，不一定能完全達(dá)到治療腫瘤的目的[15]。

本研究又利用免疫組織化學(xué)染色法觀察Ki67的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與單基因治療組比較，聯(lián)合基因治療組前列腺癌細(xì)胞增殖能力降低，而與凋亡相關(guān)的因子Stat3、Bcl-xL和c-Myc表達(dá)降低，caspase-3表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡增加。

終上所述，減毒沙門(mén)菌可作為基因治療的有效運(yùn)載體，聯(lián)合基因治療方法較單基因治療更加有效，減毒沙門(mén)菌攜帶pGRIM-19-si-survivin共表達(dá)質(zhì)粒對(duì)前列腺癌皮下移植瘤的治療作用通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖過(guò)程實(shí)現(xiàn)的，具體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還有待于進(jìn)一步深入研究。

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