林洪升， 楊海波△， 謝愷慶, 楊 利， 周靜文， 周馬林， 黃企光

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1微生物學(xué)教研室， 2第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西 南寧 530021)

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，在2012年全球新增感染人數(shù)約860萬，死亡人數(shù)為130萬。泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核作為僅次于淋巴結(jié)核的肺外結(jié)核，其中又以腎結(jié)核多見。研究表明，在受到病原微生物感染時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞因子、募集炎癥細(xì)胞啟動(dòng)局部炎癥和免疫反應(yīng)，同時(shí)腎小管上皮細(xì)胞還可以轉(zhuǎn)分化成為兼職免疫細(xì)胞表達(dá)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)，參與炎癥和免疫的調(diào)控作用[1]。TLRs作為一種重要的模式識(shí)別受體，是聯(lián)系先天性免疫和獲得性免疫的重要蛋白[2]。在參與識(shí)別結(jié)核分枝桿菌及其衍生物和促發(fā)炎癥和免疫應(yīng)答過程中，又以TLR2和TLR4為主[3-4]。但是在腎結(jié)核發(fā)病過程中，結(jié)核分枝桿菌是否通過活化TLR2和TLR4途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的損傷而參與腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化過程，目前仍不清楚。因此，我們通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證牛型結(jié)核分枝桿菌卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)TLR2和TLR4表達(dá)的影響，探討B(tài)CG 刺激TLR2和TLR4活化后對(duì)HK-2細(xì)胞的損傷作用及其生物學(xué)效應(yīng)。

材 料 和 方 法

1 菌株與細(xì)胞株

BCG由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供；人近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2購于ATCC。

2 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal calf serum,FCS)和M7H9培養(yǎng)基(Dibco)；引物合成(TaKaRa)；RNeasy Mini Kit(Qiagen)；qRT-PCR試劑盒(Roche)；鼠抗人TLR2單克隆抗體(BioLegend)；鼠抗人TLR4單克隆抗體、鼠抗人趨化因子CX3CL1單克隆抗體(R&D)；鼠抗人TGF-β1單克隆抗體(Cell Signal Technology)； CO2孵育箱(Thermo Science)；RT-PCR儀(ABI)；熒光定量PCR儀器(Eppendrof)；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-Rad)；其它Western bloting 相關(guān)試劑 (碧云天)；TLR4拮抗劑CLI-90(Invitrogen)。

3 方法

3.1BCG培養(yǎng) BCG接種于M7H9培養(yǎng)基(含10% ADC營養(yǎng)液)中，置37 ℃培養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)前，培養(yǎng)物經(jīng)研磨后，3 000×g離心7 min，用PBS洗滌2次。使用麥?zhǔn)媳葷醿x，測(cè)定菌液濁度(McFarland turbidity standard,McF)，再加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整菌液終濃度至實(shí)驗(yàn)濃度(0.7 McF)。

3.2HK-2細(xì)胞培養(yǎng)和分組干預(yù) HK-2細(xì)胞于37 ℃、5% CO2條件下，用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。HK-2細(xì)胞經(jīng)含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化后，用含10%FCS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，以每孔1×105細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，置37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%后改為無血清DMEM/F12培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化生長(zhǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。時(shí)間依賴效應(yīng)以BCG(0.7 McF)分別刺激細(xì)胞0、2、4、6、12和24 h后收集細(xì)胞。劑量依賴效應(yīng)分別用BCG(0.4、0.5和0.7 McF)刺激細(xì)胞6和12 h后收集細(xì)胞。 TLR2和TLR4阻斷實(shí)驗(yàn)中，以LPS(50 μg/L)作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照，TLR2特異性抗體(10 mg/L)孵育HK-2細(xì)胞1 h后，加入BCG(0.7 McF)刺激細(xì)胞12 h， TLR4拮抗劑CLI-90(10 mg/L)孵育HK-2細(xì)胞1 h后，加入BCG(0.7 McF)刺激細(xì)胞6 h。

3.3總RNA提取和熒光定量PCR HK-2細(xì)胞的總RNA提取按照RNeasy Mini Kit說明書進(jìn)行，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)FastStart Universal SYBR Green Master說明書操作，在Mastercycler eprealplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，每組樣品設(shè)3復(fù)孔。循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，收集熒光，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 1 min，65 ℃至95 ℃以0.1 ℃/s 進(jìn)行升溫。通過基于內(nèi)參照GAPDH的定量分析，目的基因mRNA表達(dá)量用2-ΔΔCt計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平的差異，引物序列見表1。

表1 引物序列

3.4Western blotting HK-2細(xì)胞總蛋白提取根據(jù)RIPA Lysis Buffer說明書進(jìn)行，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，并以每孔50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。用PVDF膜在半干法轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用Western封閉液室溫封閉1 h。去除封閉液后，加入目的蛋白特異性抗體4 ℃條件下封閉過夜。TLR2(1∶1 000)、TLR4(2 mg/L)、CX3CL1(1 mg/L)、TGF-β1(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)抗體經(jīng)Western Ⅰ抗稀釋液稀釋。按照ECL超敏發(fā)光液說明書對(duì)膜孵育，最后在暗房顯影。條帶經(jīng)掃描后，使用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0軟件處理。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BCG刺激HK-2細(xì)胞對(duì)TLR2、TLR4、CX3CL1和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor β1，TGF-β1)表達(dá)的影響

用BCG(0.7 McF)刺激HK-2細(xì)胞并分別于 0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h時(shí)檢測(cè)相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，BCG可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TLR2、TLR4、CX3CL1和TGF-β1mRNA及蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，且呈時(shí)間依賴性。其中TLR2 mRNA和蛋白在12 h時(shí)表達(dá)最高(P<0.01)，見圖1A、2A; TLR4 mRNA和蛋白在6 h時(shí)顯著上調(diào)，見圖1B、2B; CX3CL1 mRNA表達(dá)在6 h時(shí)達(dá)到高峰(P<0.01)，蛋白則在12 h時(shí)表達(dá)量最大(P<0.01)，見圖1C、2C；TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)在12 h時(shí)有明顯提高(P<0.01)，見圖1D、2D。

2 不同濃度BCG刺激HK-2細(xì)胞對(duì)TLR2和TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

加入BCG(0.4、0.5和0.7 McF)分別刺激HK-2細(xì)胞6 h和12 h。結(jié)果顯示，BCG刺激HK-2細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)呈劑量依賴性，二者均在BCG濃度為0.7 McF時(shí)提高最顯著(P<0.01)，見圖3。

3 TLR2特異性抗體對(duì)BCG刺激HK-2細(xì)胞誘導(dǎo)CX3CL1和TGF-β1表達(dá)的影響

在加入TLR2特異性抗體封閉后，CX3CL1 mRNA和蛋白表達(dá)(圖4A、C)與BCG組相比，有明顯下調(diào)(P<0.05)。TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)(圖4B、D)在加入TLR2特異性抗體后，與BCG組相比同樣有明顯降低(P<0.05)。

4 TLR4拮抗劑CLI-90對(duì)BCG刺激HK-2細(xì)胞誘導(dǎo)CX3CL1和TGF-β1表達(dá)的影響

在加入TLR4拮抗劑封閉后，CX3CL1 mRNA和蛋白表達(dá)(圖5A、C)與BCG組相比，有明顯下調(diào)(P<0.05)。TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)(圖4B、D)在加入TLR4拮抗劑后，與BCG組相比沒有明顯變化。

討 論

近年來研究表明，腎小管上皮細(xì)胞不僅是一種腎臟組織細(xì)胞，而且還具備免疫細(xì)胞的潛質(zhì)。損傷活化后的腎小管上皮細(xì)胞不僅可以通過釋放炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子和趨化因子參與炎癥反應(yīng)，還可以作為兼職抗原提呈細(xì)胞激活T淋巴細(xì)胞。因此腎小管上皮細(xì)胞的慢性損傷在介導(dǎo)腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化中扮演重要角色[5-7]。Toll樣受體是一類參與先天性免疫應(yīng)答的重要蛋白質(zhì)分子[8]，在許多腎臟疾病中也發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[9]。有報(bào)道表明，腎小管上皮細(xì)胞是腎臟中重要的TLR2和TLR4表達(dá)細(xì)胞[10]，可以與病原微生物或其衍生物相互作用，促發(fā)先天性免疫反應(yīng)，通過釋放各種細(xì)胞因子、趨化因子以及抗菌肽等參與到感染的炎癥過程中[1]，提示在腎結(jié)核致病過程中結(jié)核分枝桿菌有可能與腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生相互作用，通過刺激腎小管上皮細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的損傷。本研究中，我們以卡介苗刺激HK-2細(xì)胞，初步探究TLR2和TLR4在結(jié)核桿菌引起腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用。

Figure 3. Effects of different concentrations of BCG on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of TLR2 (A,C) and TLR4 (B,D) in HK-2 cells. HK-2 cells was treated with different concentrations (0.4, 0.5 and 0.7 McF) of BCG for 6 h or 12 h. The expression of TLR2 and TLR4 at mRNA and protein levels was evaluated by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs 0 McF.

本研究顯示，HK-2細(xì)胞在加入BCG刺激后，TLR2和TLR4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)均呈時(shí)間、劑量依賴性增高(圖1A、1B、2A、2B和圖3)，并且TLR2在刺激12 h后，mRNA和蛋白質(zhì)水平達(dá)到最高峰(P<0.01)，TLR4在刺激6 h后，mRNA和蛋白質(zhì)水平達(dá)到最高(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其它文獻(xiàn)結(jié)果相似[11-12]，說明BCG可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)上調(diào)。此外，在BCG刺激下，2種細(xì)胞因子CX3CL1和TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)均表現(xiàn)為時(shí)間依賴性(圖1C、1D、2C、2D)。CX3CL1在BCG刺激6 h后，mRNA水平達(dá)到最高(P<0.01)，在刺激12 h后，蛋白表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.01)。TGF-β1mRNA和蛋白水平在BCG刺激后12 h達(dá)到高峰(P<0.01)。在慢性炎癥中，趨化因子CX3CL1對(duì)于中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的募集遷移起重要作用，促使腎組織內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，加重炎癥反應(yīng)[13]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1則是一種重要的致纖維化因子，過量表達(dá)的TGF-β1將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生而加重組織纖維化[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示結(jié)核桿菌可以誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)炎癥和纖維化的發(fā)生。

Figure 4. Effects of TLR2 antibody on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of CX3CL1 (A,C) and TGF-β1 (B,D) in the HK-2 cells stimulated by BCG.HK-2 cells were preincubated with TLR2 monoclonal antibody 1 h before simulated with BCG (0.7 McF) or LPS (50 μg/L) for 12 h. The mRNA and protein expression of CX3CL1 and TGF-β1 was detected by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs BCG.

為了進(jìn)一步明確BCG是否可通過激活HK-2細(xì)胞TLR2和TLR4來調(diào)節(jié)CX3CL1和TGF-β1的產(chǎn)生，我們通過TLR2特異性抗體及TLR4拮抗劑CLI-90封閉HK-2細(xì)胞TLR2和TLR4。在BCG分別刺激HK-2細(xì)胞6 h和12 h后，通過qRT-PCR方法和Western blotting方法觀察CX3CL1和TGF-β1mRNA水平和蛋白水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入TLR2特異性抗體封閉后，CX3CL1和TGF-β1mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖4A、C)與BCG組相比有明顯下調(diào)(P<0.05)；加入CLI-90后，CX3CL1 mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5A、C)與BCG組相比，有顯著降低(P<0.01)，而TGF-β1未受CLI-90影響，其mRNA和蛋白表達(dá)水平(圖5B、D)與BCG組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果提示，在BCG刺激下，CX3CL1的分泌受到TLR2和TLR4的調(diào)控，結(jié)果與Hung等[15]和Brown等[16]的結(jié)論相似。另一方面，TGF-β1的表達(dá)受到TLR2的調(diào)控，但是在加入CLI-90、BCG刺激6 h后，其mRNA和蛋白表達(dá)與BCG組并無顯著差異(P>0.05)，說明TGF-β1有可能不受TLR4的調(diào)控。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，結(jié)核桿菌可以通過活化TLR4或TLR2而介導(dǎo)腎臟炎癥和纖維化過程。

Figure 5. Effects of TLR4 inhibitor CLI-90 on the mRNA (A,B) and protein (C,D) expression of CX3CL1 (A,C) and TGF-β1 (B,D) in the HK-2 cells stimulated by BCG. After exposed to CLI-90 for 1 h, the HK-2 cells were stimulated with BCG (0.7 McF) or LPS (50 μg/L) for 6 h. The mRNA and protein expression of CX3CL1 and TGF-β1 was detected by quantitative real-time PCR and Western blotting.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control; #P<0.01 vs BCG.

我們的實(shí)驗(yàn)證明了BCG可以誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TLR2、TLR4、CX3CL1和TGF-β1表達(dá)的上調(diào)。CX3CL1表達(dá)受到TLR2和TLR4的調(diào)控，而TGF-β1表達(dá)與TLR2有關(guān)。以上結(jié)果提示，在結(jié)核分枝桿菌感染人腎小管上皮細(xì)胞時(shí)，TLR2和TLR4均可被激活。其中，TLR2和TLR4介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的過程，通過上調(diào)趨化因子CX3CL1的表達(dá)募集炎癥細(xì)胞。此外，TLR4活化后可能通過上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，直接參與調(diào)控腎小管間質(zhì)纖維化的過程。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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