黃瑞芬 高瑞賀 石 娟 宋德文 李祖梅

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (夷陵區(qū)黃花鄉(xiāng)林業(yè)管理站)

湖北三峽地區(qū)松材線蟲(chóng)的耐寒性1)

黃瑞芬 高瑞賀 石 娟 宋德文 李祖梅

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083) (夷陵區(qū)黃花鄉(xiāng)林業(yè)管理站)

為了探究松材線蟲(chóng)的耐寒性，以采自湖北省宜昌市夷陵區(qū)的松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)為試驗(yàn)對(duì)象，研究低溫及低溫馴化對(duì)松材線蟲(chóng)存活情況的影響。結(jié)果表明：松材線蟲(chóng)有較強(qiáng)的耐低溫能力，在10、5、0、-5、-10 ℃低溫條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，松材線蟲(chóng)存活率逐漸降低，各溫度半致死時(shí)間分別為20.17、35.63、30.65、1.17 d，其中-10 ℃低溫條件下短暫暴露，線蟲(chóng)全部死亡。此外，在0 ℃和5 ℃條件下經(jīng)不同時(shí)間馴化后，-5 ℃暴露處理24 h，松材線蟲(chóng)的存活率顯著提高，表明松材線蟲(chóng)耐寒性隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)顯著提高，但是0 ℃和5 ℃兩種馴化溫度對(duì)松材線蟲(chóng)的耐寒性增加差異不顯著。

松材線蟲(chóng)；耐寒性；低溫馴化

松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)是一種世界性的植物檢疫性有害生物，分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，尤其是松林種植區(qū)分布廣泛，是對(duì)松林危害最嚴(yán)重的一種植物病原線蟲(chóng)。我國(guó)于1982年在南京中山陵的黑松上首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)病以來(lái)，據(jù)我國(guó)林業(yè)局公布最新的疫區(qū)公告[1]可知，疫情已擴(kuò)大到陜西、河南、安徽和山東等15個(gè)省，對(duì)我國(guó)森林生態(tài)系統(tǒng)造成不可估量的損失。松材線蟲(chóng)病的擴(kuò)散和發(fā)生過(guò)程中，環(huán)境因素起著極為重要的作用，其中溫度是最重要的影響病害發(fā)生的環(huán)境非生物因子之一，也是限制松材線蟲(chóng)病分布的主要?dú)夂蛞蜃覽2]。根據(jù)日本的研究發(fā)現(xiàn)[3]，松材線蟲(chóng)病在年平均氣溫低于10 ℃的地區(qū)不發(fā)生；在年平均氣溫10～12 ℃的地區(qū)能夠生存，零星發(fā)生危害；在年平均氣溫12～14 ℃的地區(qū)可以流行；在年平均氣溫高于14 ℃的地區(qū)可暴發(fā)流行。但據(jù)我國(guó)松材線蟲(chóng)疫區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[4]，在林間感染松材線蟲(chóng)的松樹(shù)有在越年春季死亡的現(xiàn)象，而且在一些年平均溫度為8 ℃左右的高海拔地區(qū)也有松材線蟲(chóng)病的發(fā)生。因此，在不同生境條件下，松材線蟲(chóng)繁殖型需要忍受低溫，且具有一定的耐受低溫的能力。松材線蟲(chóng)對(duì)低溫的適應(yīng)能力是決定其在自然條件下存活和分布的重要因素之一。截止目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于松材線蟲(chóng)的耐寒性研究較少，基于此，筆者以采自湖北省宜昌市夷陵區(qū)的松材線蟲(chóng)為試驗(yàn)對(duì)象，研究低溫及低溫馴化對(duì)松材線蟲(chóng)存活情況的影響，旨在對(duì)松材線蟲(chóng)的耐寒性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

松材線蟲(chóng)的收集及鑒定：松材線蟲(chóng)樣品來(lái)自湖北省宜昌市夷陵區(qū)疫區(qū)，用貝曼漏斗法從馬尾松(Pinusmassoniana)中分離收集線蟲(chóng)，將供試線蟲(chóng)在65 ℃的水浴下處理2 min，F(xiàn)G固定液(福爾馬林+甘油)固定，在Leica DMLB2生物顯微鏡下觀察線蟲(chóng)形態(tài)特征。形態(tài)測(cè)計(jì)用De Man公式。參照謝輝分類系統(tǒng)[5]確定各線蟲(chóng)分類地位。

松材線蟲(chóng)的接種及培養(yǎng)：接灰葡萄孢(Botrytiscinerea)菌絲塊至PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃下經(jīng)4～7 d，菌絲鋪滿培養(yǎng)皿后，挑取經(jīng)形態(tài)鑒定的、發(fā)育健全的并表面消毒過(guò)的松材線蟲(chóng)50條雌蟲(chóng)和50條雄蟲(chóng)(用0.52%次氯酸鈉表面消毒)接種至灰葡萄孢菌絲上，置于25 ℃條件下培養(yǎng)，待線蟲(chóng)將菌絲被吃完2/3左右，即可獲得純化好的大量蟲(chóng)株，分離收集并于4 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

低溫處理方法：配置大約3 000條·mL-1線蟲(chóng)懸浮液(1.0 mL)轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，根據(jù)試驗(yàn)要求分別放置到10、5、0、-5、-10 ℃的低溫反應(yīng)浴中，-5 ℃下分別于0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0 d觀察線蟲(chóng)的存活率，其他溫度間隔10 d觀察線蟲(chóng)的存活率，連續(xù)觀察6次。每個(gè)處理5次重復(fù)。

低溫馴化處理：設(shè)0、5 ℃為馴化溫度。處理前，大量培養(yǎng)松材線蟲(chóng)，待灰葡萄孢菌絲吃完2/3左右，將培養(yǎng)皿分別置于馴化溫度處理1、3、5、7 d，馴化完成之后分離線蟲(chóng)，配制濃度為3 000條·mL-1的線蟲(chóng)懸浮液，置于-5 ℃進(jìn)行低溫暴露試驗(yàn)。并將25 ℃培養(yǎng)的線蟲(chóng)作為對(duì)照組進(jìn)行相同處理，重復(fù)5次。

線蟲(chóng)的活力觀察與計(jì)數(shù)：將處理過(guò)的線蟲(chóng)在室溫下分離后放置24 h后，搖勻吸取約100 μL線蟲(chóng)，經(jīng)物理刺激(用移液槍吹打數(shù)次)后，顯微鏡下觀察，能進(jìn)行較強(qiáng)地卷曲和伸展運(yùn)動(dòng)的、頭部有輕微卷曲，或尾部微弱擺動(dòng)的線蟲(chóng)均判為存活線蟲(chóng)；不動(dòng)的線蟲(chóng)判為死亡線蟲(chóng)。用計(jì)數(shù)器對(duì)活蟲(chóng)和死蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其存活率。

數(shù)據(jù)處理：利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)低溫暴露試驗(yàn)所得的結(jié)果進(jìn)行概率分析，用Duncan多重比較分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 0 ℃以上低溫對(duì)松材線蟲(chóng)存活的影響

0、5、10 ℃的低溫暴露試驗(yàn)表明(表1)，松材線蟲(chóng)對(duì)0 ℃以上的低溫表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，處理20d后存活率仍高于70%，但隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，松材線蟲(chóng)的存活率顯著降低。松材線蟲(chóng)在10 ℃的存活時(shí)間比5 ℃和0 ℃要短，10 ℃處理30 d后存活率顯著下降至27.43%，50 d后存活率率為0，而經(jīng)5 ℃和0 ℃處理60 d的存活率分別為15.73%和13.59%。且10、5、0 ℃處理下松材線蟲(chóng)的LT50分別為20.17、35.63、30.65 d，其中5 ℃和0 ℃顯著高于10 ℃，原因可能是松材線蟲(chóng)在10 ℃的主要致死因素不是低溫，而是由于線蟲(chóng)本身的新陳代謝速度加快，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快而在短時(shí)間內(nèi)快速死亡所致。5 ℃以下隨溫度降低LT50的值逐漸縮短，但兩者間無(wú)顯著差異。隨著0 ℃和5 ℃處理時(shí)間的延長(zhǎng)，顯微鏡下觀察線蟲(chóng)的角質(zhì)膜會(huì)增厚，體腔內(nèi)內(nèi)含物濃稠，逐漸呈深黑色，部分活蟲(chóng)體的腸區(qū)和生殖系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)油狀類脂質(zhì)體，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化能使松材線蟲(chóng)更好的適應(yīng)不良環(huán)境，這可能也是后期線蟲(chóng)存活率下降速度減慢的原因。

表1 0 ℃以上低溫對(duì)松材線蟲(chóng)存活率的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。

2.2 0 ℃以下低溫對(duì)松材線蟲(chóng)存活的影響

松材線蟲(chóng)在-5、-10 ℃低溫下處理不同時(shí)間后的存活率如表2所示。由表2可知：松材線蟲(chóng)的存活率隨處理天數(shù)的增加而顯著下降，相對(duì)于0 ℃以上低溫(表1)，松材線蟲(chóng)對(duì)0 ℃以下的低溫適應(yīng)能力顯著減弱。-5 ℃處理1 d，存活率顯著下降為50.28%；處理6 d，松材線蟲(chóng)的存活率僅為7.16%。-5 ℃的LT50的值為1.17 d。-10 ℃處理12 h后，松材線蟲(chóng)存活率為0。

表2 0 ℃以下低溫對(duì)松材線蟲(chóng)存活率的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。

2.3 低溫馴化效應(yīng)

松材線蟲(chóng)經(jīng)5 ℃和0 ℃不同時(shí)間的馴化處理后，在-5 ℃檢測(cè)馴化效果，結(jié)果表明(表3)：-5 ℃暴露處理24 h后，經(jīng)0、5 ℃馴化處理3d的松材線蟲(chóng)的存活率顯著高于未經(jīng)馴化的(p<0.05),存活率分別提高至58.8%和62.3%；經(jīng)7 d馴化處理的，存活率進(jìn)一步顯著提高到86.76%和90.70%，且隨馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，耐寒性的差異顯著(p<0.05)，但是對(duì)0 ℃和5 ℃兩種馴化溫度對(duì)松材線蟲(chóng)的耐寒性增加作用不顯著(p>0.05)。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)室條件下，將經(jīng)真菌培養(yǎng)所得的松材線蟲(chóng)置于2～5 ℃冷藏保存，可存活數(shù)月之久，表明松材線蟲(chóng)對(duì)0 ℃以上溫度具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。張建平等[4]的研究表明：在線蟲(chóng)懸浮液中加入20%的甘油，線蟲(chóng)在-20 ℃條件下可以存活8 d，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)證實(shí)了松材線蟲(chóng)的繁殖期蟲(chóng)態(tài)對(duì)短時(shí)0 ℃以下低溫的抗逆性。但張建平等[4]并未進(jìn)行松材線蟲(chóng)在不同低溫下的存活時(shí)間的研究。

表3 低溫馴化的松材線蟲(chóng)在-5 ℃暴露處理下的存活率

注：表中數(shù)據(jù)為平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示不同處理間差異顯著(p<0.05)。

本研究設(shè)置了5個(gè)低溫梯度探索低溫對(duì)松材線蟲(chóng)存活率的影響，結(jié)果顯示，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，松材線蟲(chóng)的存活率逐漸降低。其中10 ℃處理50 d后松材線蟲(chóng)的存活率為0，5 ℃存活率為37.4%，0 ℃存活率為27.64%，后期松材線蟲(chóng)的存活率變化率降低。相比0 ℃以上的溫度，0 ℃以下的溫度松材線蟲(chóng)存活時(shí)間顯著下降，-5 ℃處理短期存活率迅速下降，5 d后存活率為16.67%，當(dāng)溫度降到-10 ℃時(shí)，短時(shí)間內(nèi)全部死亡。低溫暴露試驗(yàn)顯示：繁殖型線蟲(chóng)能夠耐受0 ℃以上的低溫脅迫，但不能很好地在0 ℃以下的低溫環(huán)境中存活，這與己有的線蟲(chóng)耐寒性機(jī)制的研究報(bào)道不同。在節(jié)肢動(dòng)物的耐寒性研究中，耐寒性并不局限在耐凍和避凍兩種類型內(nèi)，還包括耐受寒冷型、寒冷敏感型以及機(jī)會(huì)主義型[6-7]。對(duì)于寒冷敏感型動(dòng)物，其特點(diǎn)是能在0 ℃到5 ℃存活，在-5 ℃到-15 ℃短暫的冷暴露會(huì)增加其死亡率。因此，認(rèn)為繁殖型松材線蟲(chóng)屬于寒冷敏感型，這與戴素明等的研究結(jié)果[8]一致。

一些南極線蟲(chóng)(Panagrolaimusdavidi)冬季種群的過(guò)冷卻點(diǎn)低于夏季種群的過(guò)冷卻點(diǎn)。過(guò)冷卻點(diǎn)的轉(zhuǎn)變說(shuō)明線蟲(chóng)具有馴化效應(yīng)，經(jīng)過(guò)低溫馴化后的線蟲(chóng)耐寒性會(huì)顯著增強(qiáng)，這種馴化效應(yīng)在其它線蟲(chóng)也得到證明[9-13]。Wharton等[14]研究表明，南極線蟲(chóng)在5 ℃和0 ℃的馴化下，能提高線蟲(chóng)在-12 ℃低溫處理下的存活率，馴化時(shí)間對(duì)存活率的影響差異顯著，但是馴化溫度差異不顯著，這與本研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，松材線蟲(chóng)是可馴化的，在5、0 ℃條件下隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，耐寒性會(huì)顯著提高，但是兩個(gè)馴化溫度差異不顯著。在松材線蟲(chóng)相對(duì)適應(yīng)性較強(qiáng)的溫度下進(jìn)行低溫馴化，其耐寒性表現(xiàn)出隨馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)的趨勢(shì)，這可能與松材線蟲(chóng)內(nèi)部的新陳代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。Zhao等[15]研究表明，松材線蟲(chóng)在4、0 ℃條件下處理60 d后，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化，角質(zhì)層增厚，呈深黑色，腸區(qū)出現(xiàn)油滴狀類脂質(zhì)體，對(duì)低溫等惡劣環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力。線蟲(chóng)經(jīng)低溫鍛煉，可誘發(fā)生物體產(chǎn)生一些抗冷凍的低分子物質(zhì)產(chǎn)生，從而耐寒性得到增強(qiáng)。研究表明，南極線蟲(chóng)經(jīng)過(guò)馴化后海藻糖含量顯著增加，且海藻糖的含量對(duì)線蟲(chóng)長(zhǎng)期的低溫存活率有顯著的影響[13]。類似的研究結(jié)果也可在昆蟲(chóng)病原線蟲(chóng)Steinernemafeltiae和Heterorhabditisbacteriophora耐寒性機(jī)制研究中得到，經(jīng)過(guò)低溫馴化后，海藻糖的含量在5 ℃比25 ℃時(shí)顯著增加[16-17]。類似的結(jié)果在松材線蟲(chóng)中也存在，冷激后的松材線蟲(chóng)體內(nèi)的海藻糖含量增加了48.78%，說(shuō)明海藻糖的聚集與低溫有關(guān)[7]，但其與松材線蟲(chóng)耐寒性的相關(guān)性還有待進(jìn)一步的研究。

松材線蟲(chóng)生活史中雖然存在著繁殖型和分散型兩個(gè)階段，而且其主要以分散3齡型越冬，但是松材線蟲(chóng)病會(huì)在一些常年低溫的高海拔地區(qū)發(fā)生，說(shuō)明繁殖型松材線蟲(chóng)對(duì)低溫有一定的適應(yīng)性，耐寒性的研究對(duì)于松材線蟲(chóng)病在一個(gè)國(guó)家和地區(qū)的分布能否向北擴(kuò)散并建立穩(wěn)定的種群及成功預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和根治害蟲(chóng)方面都起著至關(guān)重要的作用，并且能為明確松材線蟲(chóng)的生活史對(duì)策、生理生化調(diào)節(jié)和選擇進(jìn)化機(jī)制，以及明確其發(fā)生擴(kuò)散原因、種群發(fā)生趨勢(shì)和種群控制措施等提供理論依據(jù)。

[1] 國(guó)家林業(yè)局.2013年松材線蟲(chóng)病疫區(qū)[EB/OL].(2013-01-17)[2014-09-04].http://www.forestry.gov.cn/main/3600/content-657977.html.

[2] 楊寶軍,潘宏陽(yáng),湯堅(jiān),等.松材線蟲(chóng)病[M].北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2003:69-71.

[3] Mamiya Y. History of pine wilt desease in Japan[J]. Journal of Nematology,1988,20(2):219-226.

[4] 張建平,蔡新.溫度對(duì)松材線蟲(chóng)的生物效應(yīng)[J].四川林業(yè)科技,2007,28(5):69-72.

[5] 謝輝.植物線蟲(chóng)分類學(xué)[M].合肥:安徽科學(xué)技術(shù)出版社,2000:53-55.

[6] 景曉紅,康樂(lè).昆蟲(chóng)耐寒性研究[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2002,22(12):2202-2207.

[7] Hayashi M, Wharton D A. The oatmeal nematode Panagrellus redivivus survives moderately low temperatures by freezing tolerance and cryoprotective dehydration[J]. Journal of Comparative Physiology B,2011,81(3):335-342.

[8] 戴素明,成新躍,肖啟明,等.線蟲(chóng)耐寒性研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2006,26(11):3885-3889.

[9] Forge T A, MacGuidwin A E. Cold hardening ofMeloidogynehaplasecond-stage juveniles[J]. Journal of nematology,1990,22(1):101-105.

[10] Wharton D A, Goodall G, Marshall C J. Freezing rate affects the survival of a short-term freezing stress inPanagrolaimusdavidi, an Antarctic nematode that survives intracellular freezing[J]. CryoLtters,2002,23(1):5-10.

[11] Wharton D A, Goodall G, Marshall C J. Freezing survival and cryoprotective dehydration as cold tolerance mechanisms in the Antarctic nematodePanagrolaimusdavidi[J]. Journal of experimental biology,2003,206(2):215-221.

[12] Smith T, Wharton D A, Marshall C J. Cold tolerance of an Antarctic nematode that survives intracellular freezing: comparisons with other nematode species[J]. Journal of Comparative Physiology B,2008,178(1):93-100.

[13] Ali F, D A Wharton. Cold tolerance of entomopathogenic nematodes[J]. New Zealand Plant Protection,2009,64(1):396.

[14] Wharton D A, Judge K F, Worland M R. Cold acclimation and cryoprotectants in a freeze-tolerant Antarctic nematode,Panagrolaimusdavidi[J]. Journal of Comparative Physiology B,2000,170(4):321-327.

[15] Zhao Lilin, Wei Wei, Kulhavy D L, et al. Low temperature induces two growth-arrested stages and change of secondary metabolites inBursaphelenchusxylophilus[J]. Nematology,2007,9(5):663-670.

[16] Ali F, Wharton D A. Cold tolerance abilities of two entomopathogenic nematodes,SteinernemafeltiaeandHeterorhabditisbacteriophora[J]. Cryobiology,2013,66(1):24-29.

[17] Grewal P S, Jagdale G B. Enhanced trehalose accumulation and desiccation survival of entomopathogenic nematodes through cold preacclimation[J]. Biocontrol Science and Technology,2002,12(5):533-545.

Cold Tolerance ofBursaphelenchusxylophilusin the Three Gorges Region of Hubei Province

/Huang Ruifen, Gao Ruihe, Shi Juan

(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Song Dewen, Li Zumei(Station of Forestry Management of Huanghua Town Yiling District)//Journal of Northeast Forestry University.-2014,42(11).-138～141

In order to explore the cold tolerance ofBursaphelenchusxylophilus, we tookB.xylophilusfrom Yiling District, Yichang City, Hubei Province to examine how low temperature and cold acclimation affected survival rate ofB.xylophilus.B.xylophiluswas relatively cold resistant with median level, and the survival rate decreased with the increase of cold exposure time. The median lethal time ofB.xylophiluswere 20.17, 35.63, 30.65 and 1.17 days at 10 ℃, 5 ℃, 0 ℃ and -5 ℃, respectively, and all died at -10 ℃ for short exposure. The survival rates ofB.xylophiluswere enhanced significantly at -5 ℃ for 24 hours’ exposure after different time acclimation at 5 ℃ and 0 ℃. The cold acclimation enhanced the cold tolerance ofB.Xylophilus, and there was a positive correlation between the acclimation and cold tolerant, but there was no significant cold tolerant increase at 5 ℃ and 0 ℃.

Bursaphelenchusxylophilus; Cold tolerance; Cold acclimation

1) 國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201204501)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31170613)；北京高等學(xué)校青年英才計(jì)劃資助(YETP0740)。

黃瑞芬，女，1989年8月生，北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。

石娟，北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，副教授。E-mail：shi_juan@263.net。

2014年3月20日。

S763.301；Q959.17

責(zé)任編輯：程 紅。