翟李剛+林春花+蔡志英+時濤+黃貴修

摘要：細胞自噬（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ）有助于植物病原真菌渡過營養(yǎng)饑餓、供氧不足等不良環(huán)境，有研究發(fā)現(xiàn)其與植物病原真菌的致病性相關。利用橡膠膠孢炭疽菌ＨＢＣｇ０１全基因組數(shù)據庫，采用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ克隆細胞自噬相關基因ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登錄號：ＫＣ７３５１２５），并對其序列進行分析，研究細胞自噬在膠孢炭疽菌侵染橡膠樹過程中的作用。結果表明，ＣｇＡtg４的開放閱讀框（ＯＲＦ）為９６０ ｎｔ，編碼３１９個ａａ序列，預測含有一個由２１３個ａａ組成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結構域，與另外１９種真菌的Ａtg４氨基酸序列同源性為３８％～８７％。推測ＣｇＡtg４可能與橡膠樹膠孢炭疽病菌的產孢能力、分生孢子萌發(fā)以及附著胞膨壓的形成相關。

關鍵詞：橡膠樹；膠孢炭疽菌；自噬相關基因；ＣｇＡtg４

中圖分類號：Ｓ４３２．４＋４；Q75文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2189-03

Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４ ｆｒｏｍ

Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ｏｆ Ｒｕｂｂｅｒ Tree

ＺＨＡＩ Ｌｉ－ｇａｎｇ１，２，ＬＩＮ Ｃｈｕｎ－ｈｕａ１，ＣＡＩ Ｚｈｉ－ｙｉｎｇ１，ＳＨＩ Ｔａｏ１，ＨＵＡＮＧ Ｇｕｉ－ｘｉｕ１

（１．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ/Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ/Ｈａｉｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｓｔｓ，Ｈａｉｋｏｕ ５７１１０１， Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｃａｎ ｈｅｌｐ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｈｕｎｇｅｒ， ｏｘｙｇｅｎ ｈｕｎｇｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ. ａｎｄ It is found to be ｒｅｌａｔｅｄ with ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ ｓｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈes． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ explore ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ， ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ＣｇＡtg４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ｎｕｍｂｅｒ：ＫＣ７３５１２５） ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ database of ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ ＨＢＣｇ０１ ｇｅｎｏｍｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ＣｇＡtg４ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ） ｗａｓ ９６０ ｎｔ， ｃｏｄｉｎｇ ３１９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅ with ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４ ｗｉｔｈ ２１３ ａａ． Ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ ＣｇＡtg４ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ Ａtg４ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ １９ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌｓ was ３８％ ｔｏ ８７％． Ｉｔ ｉｓ predictal that ＣｇＡtg４ ｇｅｎｅ is ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉｏｐｈｏｒｅ ｇｅｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ of rubber tree Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ； Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ； ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ； ＣｇＡtg４

細胞自噬（Autophagy）是真核生物中廣泛存在的作用機制，且在進化上十分保守，它是真核生物中對細胞內蛋白質和細胞器進行周轉的重要過程，該過程中一些損壞的蛋白質或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或液泡中進行降解并得以循環(huán)利用。自噬過程中最為重要的兩個環(huán)節(jié)是自噬過程的誘導和自噬體的形成，參與此過程的至少有１７個Ａｔｇ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，細胞自噬相關）蛋白，被分為５個功能組［１］：Ⅰ．Ａｔｇ１激酶功能組（Ａｔｇ１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）；Ⅱ．Ａｔｇ９膜蛋白循環(huán)系統(tǒng)（Ａｔｇ９ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅲ．Ａｔｇ８－磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）功能組（Ａｔｇ８ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅳ．Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５復合體功能組（Ａｔｇ１２－Ａｔｇ５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）；Ⅴ．磷脂酰肌醇轉移蛋白３（ＰｔｄＩｎｓ３）－激酶復合體（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）。Ａｔｇ４基因屬于Ａｔｇ８－磷脂酰乙醇胺（ＰＥ）功能組，該基因能切割Ａｔｇ８羧基端的精氨酸，暴露出甘氨酸［２］，并在Ａｔｇ７和Ａｔｇ３的共同調節(jié)作用下形成Ａｔｇ８蛋白與磷脂酰乙醇胺復合物（Ａｔｇ８－ＰＥ），從而促進自噬體前體膜的聚集和融合［３］，進一步形成自噬體。

炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐｐ．）是一類常見且最重要的植物病原真菌之一，引起各種農作物炭疽病，造成重大的經濟損失［４］。炭疽病已成為研究植物病原真菌生長發(fā)育、侵染過程及植物與病原菌互作機制的典型材料。由膠孢炭疽菌［Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ （Ｐｅｎｚｉｇ） Ｐｅｎｚｉｇ ｅｔ Ｓａｃｃａｒｄｏ］侵染引起的橡膠樹炭疽?。郏担菔窍鹉z樹重要葉部病害之一。該病可危害橡膠小苗、大田幼樹直至成齡開割樹，侵染葉片、葉柄和果實，嚴重時會引起橡膠樹的重復落葉和嫩梢回枯，推遲開割時間［６］。至今，未見炭疽菌細胞自噬相關基因的報道。本研究在橡膠樹膠孢炭疽菌全基因組測序的基礎上，以細胞自噬基因家族中與自噬體形成相關的Ａｔｇ４基因為研究對象，對其進行基因克隆和序列分析，為后續(xù)的基因功能鑒定提供參考。

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１材料與方法

１．１供試材料

供試橡膠樹膠孢炭疽病菌菌株ＨＢＣｇ０１，由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所分離自海南省儋州市發(fā)病橡膠樹葉片。橡膠樹品種熱研７－３３－９７，由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所提供。

１．２試劑

ＨＢＣｇ０１病菌培養(yǎng)采用ＰＤＡ培養(yǎng)基，參照方中達［６］的方法制備。試劑：ＤＮＡ片段膠回收試劑盒、ｐＭＤ１８－Ｔ載體、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ購自寶生物工程（大連）有限公司；Ｔａｑ酶和ｄＮＴＰ購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌Ｔ１感受態(tài)細胞和ＲＮＡ提取試劑盒ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ購自北京全式金生物技術有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；其他試劑均為國產分析純。

１．３方法

１．３．１引物設計在ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）數(shù)據庫中搜索近源物種的Ａtg４基因序列，在ＨＢＣｇ０１全基因組數(shù)據庫中分別進行本地Ｂｌａｓｔ檢索，獲得ＨＢＣｇ０１中的同源基因，根據５′端和３′端序列設計１對引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ。

１．３．２ＨＢＣｇ０１基因組ＤＮＡ、ＲＮＡ提取和ｃＤＮＡ的合成菌株在ＰＤＡ平板上２８ ℃培養(yǎng)７ ｄ后，收集菌絲。采用ＣＴＡＢ法［７］提取基因組ＤＮＡ。采用ＴｒａｎｓＺｏｌ Ｐｌａｎｔ和ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ試劑盒，參照說明書中相關步驟進行ＲＮＡ提取，去除基因組ＤＮＡ和ＲＮＡ的反轉錄。

１．３．３Ａtg４基因的ＰＣＲ擴增、克隆與序列分析 以ＨＢＣｇ０１基因組ＤＮＡ和ｃＤＮＡ為模板，用引物對ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ進行ＰＣＲ擴增，反應體系為：１０×ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）４ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，１０ μｍｏｌ／Ｌ上下游引物各２ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，模板ＤＮＡ／ｃＤＮＡ ２ μＬ，加水補足至５０ μＬ。反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ，９４ ℃變性４５ ｓ，６０ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個循環(huán)，７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。擴增產物用質量分數(shù)１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收目的片段。

擴增產物回收后克隆到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上。經藍白斑篩選后，采用堿裂解法［8］提取轉化子的質粒ＤＮＡ，經ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ雙酶切鑒定、菌落ＰＣＲ鑒定后，隨機挑選３個陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進行序列測定，確認序列后在ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ上進行比較分析，并預測相應蛋白質的保守結構域。采用ＤＮＡＭＡＮ軟件將測序的核酸序列翻譯成氨基酸序列，并在ＮＣＢＩ上對其進行Ｂｌａｓｔｐ檢索，下載其他近源真菌的同源氨基酸序列，用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０軟件中的ＮＪ（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）方法生成系統(tǒng)樹，用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ對系統(tǒng)樹進行檢驗，１ ０００次重復。

２結果與分析

２．１引物的設計

利用稻瘟菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ）Ａｔｇ４基因（ＡＣＪ０６５８７．１）的ａａ序列和菌株ＨＢＣｇ０１的基因組數(shù)據庫進行本地Ｂｌａｓｔ，結果表明該菌株中有一個預測的同源基因，分析其大小約１．１ ｋｂ，命名為ＣｇＡｔｇ４。根據該基因的５′端和３′端序列設計了１對引物ＡＴＧ４－Ｆ（５′－ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＴＣ－３′）、ＡＴＧ４－Ｒ（５′－ＧＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＴ３－′）。

２．２橡膠樹膠孢炭疽菌ＣｇＡｔｇ４基因的克隆

利用引物ＡＴＧ４－Ｆ和ＡＴＧ４－Ｒ對ＨＢＣｇ０１的基因組ＤＮＡ和ｃＤＮＡ進行ＰＣＲ擴增，分別得到約１．１ ｋｂ和１．０ ｋｂ的條帶（圖１），與預期的條帶大小一致。測序結果顯示，以基因組ＤＮＡ為模板擴增得到的產物大小為１ １２９ kb，以ｃＤＮＡ為模板擴增得到的產物大小為９６０ kb。

２．３ＣｇＡｔｇ４基因的序列分析

生物信息學分析表明，ＣｇＡｔｇ４基因含有一個完整的開放閱讀框（ＯＲＦ），含有３個外顯子和２個內含子，編碼３１９個ａａ殘基，分子量約為３５．０１ ｋＤ，等電點PＩ為５．１４，含有１１６個疏水性殘基和２０３個親水性殘基，預測蛋白質中含有一個由２１３個ａａ組成的高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結構域（圖２）。該序列已提交ＮＣＢＩ數(shù)據庫，登錄號為ＫＣ７３５１２５。

在ＮＣＢＩ上將ＣｇＡtg４氨基酸序列進行Ｂｌａｓｔｐ檢索，下載１９個菌株的Ａtg４基因氨基酸序列，利用ＭＥＧＡ Vｅｒｓｉｏｎ ４．０軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖３）。結果表明，ＣｇＡｔｇ４與膠孢炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ，ＥＬＡ２５６００．１）、菜心炭疽菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ，ＣＣＦ３９２７１．１）以及小叢殼屬真菌（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ ＥＦＱ３６７５０．１）的同源性相對較高，分別為８７％、７８％和８０％，親緣關系最近；與黏紅酵母（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ，ＥＧＵ１３５８７．１）和釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ＥＤＺ６９８０６．１）的Ａｔｇ４氨基酸序列同源性較低，分別為４３％和３８％，親緣關系最遠。

３討論

１９６２年，Ａｓｈｆｏｒｄ等［９］用電子顯微鏡在人的肝細胞中首次觀察到細胞自噬現(xiàn)象。關于該現(xiàn)象調控機制方面的研究較少，其作用機理尚不清楚。上世紀９０年代以來，酵母作為一種模式生物受到了關注，研究者開展了大量的自噬作用機制研究。目前，已發(fā)現(xiàn)３０多個基因參與酵母的自噬作用，其中１７個基因參與自噬泡的形成［１０］。

近年來有研究表明，細胞自噬過程與病原真菌的致病性密切相關。在稻瘟菌中，細胞自噬過程與稻瘟病菌的產孢、附著胞膨壓、穿透、致病性以及有性生殖等各個發(fā)育階段密切相關［１１，１２］。缺失ＭｇＡｔｇ４基因后，稻瘟菌突變體菌絲稀疏、產孢量下降、附著胞膨壓降低，而且孢子萌發(fā)和附著胞形成延遲，接種大麥和水稻均不能形成病斑［１３］。ＣｇＡｔｇ４和ＭｇＡｔｇ４所編碼的氨基酸序列具有６１％的同源性，都包含一個高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結構域，推測ＣｇＡｔｇ４基因參與菌絲生長、產孢和侵染過程。

本研究成功克隆得到橡膠樹膠孢炭疽菌與細胞自噬相關的ＣｇＡｔｇ４基因，利用ＮＣＢＩ分析其具有高度保守的Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ＿Ｃ５４蛋白酶結構域?；谠摶虻模幔嵝蛄?，構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，分析了該基因氨基酸序列和其他真菌同源基因的親緣關系。本研究為進一步研究ＣｇＡｔｇ４基因在橡膠樹膠孢炭疽病菌自噬過程中的作用等提供了基礎，有助于從分子生物學層面研究細胞自噬與橡膠樹膠孢炭疽菌致病性的關系。

參考文獻：

［１］ 劉小紅，魯書玲，林福呈．細胞自噬的基因調控及其與稻瘟病的關系［Ｊ］．細胞生物學雜志，２００８，３０（６）：７３７－７４１．

［２］ ＫＩＲＩＳＡＫＯ Ｔ， ＢＡＢＡ Ｍ， ＩＳＨＩＨＡＲＡ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ ｉｓ ｔｒａｃｅｄ ｗｉｔｈ Ａｔｇ８／Ａｕｔ７ｐ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９９９，１４７（２）：４３５－４４６．

endprint

［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農業(yè)科學，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識別與防治［Ｍ］．北京：中國農業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學學報，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經典堿裂解法質粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農墾大學學報，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

endprint

［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農業(yè)科學，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識別與防治［Ｍ］．北京：中國農業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學學報，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經典堿裂解法質粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農墾大學學報，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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［３］ ＶＥＮＥＡＵＬＴ－ＦＯＵＲＲＥＹ Ｃ， ＢＡＲＯＯＡＨ Ｍ， ＥＧＡＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｕｎｇａｌ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｓ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌａｓｔ ｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，３１２（５７７３）：５８０-583．

［４］ 唐建輝，王偉．西瓜炭疽菌核糖體基因ＩＴＳ區(qū)段的克隆及序列分析［Ｊ］．安徽農業(yè)科學，２００７，３５（９）：２５６６－２５６８．

［５］ 黃貴修，許燦光．中國天然橡膠病蟲草害識別與防治［Ｍ］．北京：中國農業(yè)出版社，２０１２．

［６］ 方中達．植病研究方法［Ｍ］．第３版．北京：中國農業(yè)出版社，１９９８．

［７］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化ＣＴＡＢ法快速微量提取絲狀真菌ＤＮＡ［Ｊ］． 湛江海洋大學學報，２００３，２３（６）：７２－７３．

［８］ 孟宇，李靜，孫智峰，等．經典堿裂解法質粒大量提取方法的改良［Ｊ］．黑龍江八一農墾大學學報，２０１２，24（2）：３３－３５．

［９］ ＡＳＨＦＯＲＤ Ｔ Ｐ，ＰＯＲＴＥＲ Ｋ Ｒ． Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Cｅｌｌ Bｉｏｌｏｇｙ，１９６２，１２（１）： １９８－２０２．

［１０］ ＫＬＩＯＮＳＫＹ Ｄ Ｊ． Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ： Rｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｅｌｆ－ｃａｎｎｉｂａｌｉｓｍ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３１：３１－３２．

［１１］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ＺＨＡＮＧ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ， ＭｇＡＴＧ１， ｉｎ ａｐｐｒｅｓｓｏｒｉｕｍ ｔｕｒｇｏｒ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌ， ２００７，６（６）：９９７－１００５．

［１２］ ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ，ＬＩＮ Ｆ Ｃ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｉｄｉａｔｉｏｎ， ｃｏｎｉｄｉａｌ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｒｇｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ，２００７，３（５）：４７２－４７３．

［１３］ ＬＩＵ Ｔ Ｂ， ＬＩＵ Ｘ Ｈ， ＬＵ Ｊ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ＭｏＡｔｇ４ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭｏＡｔｇ８ ａｎｄ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ［Ｊ］． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２０１０，６（１）：７４－８５．

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