張應(yīng)花， 鄧曉慧， 王中平， 崔衛(wèi)剛,， 文小軍， 李瑞錫

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003； 2復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系，上海 200032；3九江學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，江西 九江 332000)

孤獨(dú)癥是一種廣泛的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，臨床上患兒有以下三大核心特征：語言發(fā)育延遲、社交行為障礙、重復(fù)呆板樣行為[1]，嚴(yán)重影響了患兒的語言形成、社交行為及情緒認(rèn)知。然后，孤獨(dú)癥的病因還是一個(gè)謎。孤獨(dú)癥病因不明，目前普遍認(rèn)為是遺傳和環(huán)境因素在腦發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期共同作用的結(jié)果。非遺傳因素可能與干擾胚胎腦發(fā)育的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，而遺傳因素可能是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常導(dǎo)致的基因突變所致。

經(jīng)典Wnt通路又稱為 Wnt/β-catenin 通路, 其主要成員有Wnt、Frizzled 受體、Dvl/Dsh、糖原合成酶激酶 3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、Axin、APC、β-catenin及TCF/LEF等等，其中β-catenin是關(guān)鍵分子。在存在Wnt 配體的情況下，Dvl抑制 APC、Axin和GSK3β等組成的破壞復(fù)合體。抑制破壞復(fù)合體導(dǎo)致β-catenin在胞漿中聚集，β-catenin 越聚越多，隨后移位至胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin 與 TCF/LEF轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，激活Wnt下游靶基因cyclin D1、c-myc等的轉(zhuǎn)錄。在沒有Wnt信號(hào)情況下，GSK-3β磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin被蛋白酶體降解，從而使細(xì)胞內(nèi)游離的β-catenin保持在極低的水平，這時(shí)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合，從而抑制Wnt靶基因的表達(dá)[2]。

經(jīng)典Wnt信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、分化、細(xì)胞的凋亡、突觸的形成與聯(lián)系，調(diào)控細(xì)胞、組織及器官正常有序的分化和生長發(fā)育。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在個(gè)體發(fā)育尤其是神經(jīng)發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的的作用。然而Wnt通路作用猶如雙刃劍，既是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞正常分化發(fā)育的重要通路，又是神經(jīng)發(fā)育疾病發(fā)生的成因之一，通路中任何蛋白分子表達(dá)異常，都將引起信號(hào)傳遞錯(cuò)誤，導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)的改變，進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的發(fā)生，如孤獨(dú)癥。

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常導(dǎo)致孤獨(dú)癥患者腦形態(tài)和功能異常。如β-catenin過度表達(dá)，能使神經(jīng)前體細(xì)胞增殖，可能與孤獨(dú)癥腦早期的過度增生有關(guān)，而β-catenin的失活會(huì)導(dǎo)致腦發(fā)育畸形和顱面發(fā)育不全。此外，研究發(fā)現(xiàn)，孤獨(dú)癥模型鼠存在β-catenin及其靶基因表達(dá)上調(diào)[3]，而且 β-catenin時(shí)空表達(dá)存在明顯異常。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路一個(gè)基因的突變，如Wnt1，增加下游信號(hào)通路的激活可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育及行為學(xué)表現(xiàn)異常。最近研究結(jié)果顯示，Wnt1反義突變導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路激活，可能增加了孤獨(dú)癥的易感性[4]。這些研究強(qiáng)烈提示W(wǎng)nt通路與孤獨(dú)癥的發(fā)病密切相關(guān)。故研究該信號(hào)通路及其通路中蛋白基因與孤獨(dú)癥的發(fā)病關(guān)系，對(duì)揭示孤獨(dú)癥的分子病因和發(fā)病機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

丙戊酸(valproic acid，VPA)具有抑制γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性而增強(qiáng)突觸內(nèi)γ-氨基丁酸能神經(jīng)傳遞的作用，是臨床用于治療癲癇、雙向情感障礙及偏頭痛的常規(guī)藥物。然而，近10年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，孕婦在懷孕早期服用 VPA，大大增加了子代患孤獨(dú)癥的風(fēng)險(xiǎn)。通過在懷孕早期運(yùn)用 VPA 處理孕鼠，能較好地在子代幼鼠上復(fù)制出類似孤獨(dú)癥患者表現(xiàn)出的某些癥狀，也在子代幼鼠腦區(qū)檢測(cè)出一些類似的組織結(jié)構(gòu)及生化異常。VPA動(dòng)物模型是目前公認(rèn)的較成熟的孤獨(dú)癥動(dòng)物模型[5]。為此，本實(shí)驗(yàn)擬用VPA孤獨(dú)癥動(dòng)物模型研究經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活性變化，以揭示孤獨(dú)癥發(fā)生的可能機(jī)制，為孤獨(dú)癥的分子病因提供有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1主要材料和試劑 VPA購自Sigma；兔抗GSK-3β、phospho-GSK-3β和phospho-β-catenin抗體購于Cell Signaling Technology；兔抗β-catenin抗體購于Santa Cruz；小鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購于康成公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于Jackson；Western Ⅰ抗稀釋液、蛋白裂解緩沖液、蛋白濃度測(cè)定BCA試劑盒購于碧云天；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa，2×PCR mix購自Invitrogen，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2動(dòng)物 健康成年雄性(300～350 g)及雌性(200～250 g) Wistar大鼠，購自中國科學(xué)院(上海)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系專用動(dòng)物房，給予充分的飼料和飲水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格遵照復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條款。

2 方法

2.1孤獨(dú)癥大鼠模型建立 Wistar大鼠在周期性光照(7:00 AM～7:00 PM)、恒溫 25 ℃和恒濕 55%條件下飼養(yǎng)數(shù)天，使之適應(yīng)環(huán)境。然后，按雌∶雄 2∶1合籠過夜。第2天早晨，檢查到陰栓的雌鼠記為E1 d， 然后分籠單獨(dú)飼養(yǎng)。參照Schneider等[6]使用的方法，將受孕母鼠隨機(jī)分成2組：模型組在 E12.5 d時(shí)給予母鼠600 mg/kg VPA (ip)，VPA粉末用0.85%生理鹽水(normal saline，NS)配成 250 g/L的溶液。對(duì)照組母鼠給予同等量的 NS (ip)。模型組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為VPA 孤獨(dú)癥模型鼠(VPA組)；對(duì)照組母鼠產(chǎn)下的仔鼠記為正常對(duì)照組(control組)。仔鼠在出生后23 d (postnatal day 23, PND23)斷乳。VPA 組仔鼠和control 組仔鼠分別取 8只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2孤獨(dú)癥模型動(dòng)物生長發(fā)育和行為學(xué)檢測(cè) 為觀察PND7～10幼鼠的方向趨向性機(jī)能，分別取6只 VPA組及control組子代鼠，將幼鼠頭朝下放置在 25°光滑傾斜平面上，觀察幼鼠轉(zhuǎn)動(dòng)180°的活動(dòng)情況，記錄比較VPA組及control組子代鼠完成轉(zhuǎn)動(dòng)所花費(fèi)的時(shí)間平均值。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)反映了幼鼠方向感覺及運(yùn)動(dòng)機(jī)能等的總體發(fā)育水平。PND23的幼鼠進(jìn)行熱平板實(shí)驗(yàn)，幼鼠測(cè)試前適應(yīng)環(huán)境30 min。使用GJ-8402型熱板測(cè)痛儀致痛，準(zhǔn)確調(diào)節(jié)熱板溫度在(55.0±0.5)℃，并用水銀溫度計(jì)校對(duì)。以放入幼鼠開始計(jì)時(shí)，至鼠翹起后足或舔后足為止，所經(jīng)歷的時(shí)間作為痛反應(yīng)的指標(biāo)，此時(shí)間即為痛閾值。22 s為最大刺痛閾值，以避免對(duì)組織造成損傷。每只動(dòng)物重復(fù) 3 次，間隔時(shí)間為 15 min。每次由不同的檢測(cè)者進(jìn)行測(cè)試，記錄比較VPA組及control組子代鼠平均痛閾值。

2.3Western blotting檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路信號(hào)分子蛋白水平的表達(dá) 用蛋白裂解液提取大鼠前額葉皮質(zhì)與海馬腦組織總蛋白質(zhì)，用BCA法測(cè)定樣品的蛋白濃度。加入5×loading buffer后，100 ℃加熱變性3 min。進(jìn)行12%SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白TBST搖床常溫封閉2 h。加Ⅰ抗，4 ℃搖床過夜；加Ⅱ抗和GAPDH搖床常溫1 h，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，然后將PVDF膜置于Bio-Rad的顯影機(jī)上，獲取反應(yīng)條帶的數(shù)字圖并將條帶進(jìn)行灰度測(cè)定，以目的蛋白和內(nèi)參照GAPDH蛋白的灰度比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.4半定量RT-PCR檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路信號(hào)分子mRNA水平的表達(dá) 用Trizol提取大鼠前額葉皮質(zhì)與海馬腦組織總RNA。A260/A280比值在1.8～2.0之間。根據(jù)GenBank提供的基因序列使用Primer Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。引物序列參照表1。RT-PCR按照說明書進(jìn)行操作,反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min變性，然后95 ℃，30 s,57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖(溶于1×TBE)凝膠電泳分離，在Runone DNA電泳系統(tǒng)中進(jìn)行，用數(shù)字成像系統(tǒng)分析圖像，以目的基因灰度與內(nèi)參照基因灰度比值代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間比較用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孤獨(dú)癥模型動(dòng)物生長發(fā)育及行為學(xué)檢測(cè)比較

當(dāng)把大鼠頭朝下放置在傾斜平面時(shí)，大鼠有自動(dòng)轉(zhuǎn)身 180°而頭保持朝上的本能。轉(zhuǎn)身過程所用時(shí)間的長短反映了大鼠前庭感覺及運(yùn)動(dòng)機(jī)能的發(fā)育情況。在檢測(cè)的各年齡段，孤獨(dú)癥模型組仔鼠轉(zhuǎn)身所用時(shí)間較對(duì)照組顯著增加，見圖1A，表明VPA處理對(duì)子代鼠的前庭感覺及活動(dòng)造成不利影響。熱平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，孤獨(dú)癥模型組痛閾值比正常對(duì)照組明顯增加，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1B，說明孤獨(dú)癥模型組痛覺明顯比對(duì)照組遲鈍，逃避傷害性刺激動(dòng)作遲緩，對(duì)傷害性知覺不敏感。以這些模型動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，做后續(xù)實(shí)驗(yàn)是可靠的。

表1 半定量RT-PCR引物序列

Figure 1. Geotaxis and thermal hyperalgesia in autistic and control rats. A: geotaxis; B: pain threshold. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2 孤獨(dú)癥大鼠經(jīng)典Wnt信號(hào)通路GSK-3β及β-catenin mRNA表達(dá)變化

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，孤獨(dú)癥模型組GSK-3β mRNA表達(dá)低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2A，而β-catenin mRNA表達(dá)高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2B。

Figure 2. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) mRNA in prefrontal cortex (PFC) and hippocampus formation (HF) of control and autism rats. Mean ±SD.n=8.*P<0.05 vs control.

3 孤獨(dú)癥大鼠經(jīng)典Wnt信號(hào)通路GSK-3β及β-catenin 蛋白及磷酸化表達(dá)變化

Western blotting結(jié)果顯示，孤獨(dú)癥模型組GSK-3β磷酸化表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3A，而β-catenin 磷酸化表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3B。

Figure 3. Expression of GSK-3β (A) and β-catenin (B) proteins in PFC and HF of control and autism rats. p-GSK-3β：phosphorylated GSK-3β (Ser 9); T-GSK-3β: total GSK-3β; p-β-catenin: phosphorylated β-catenin (ser33/37/Thr41); T-β-catenin: total β-catenin. Mean±SD. n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

4 孤獨(dú)癥大鼠經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游c-Myc及cyclin D1 mRNA表達(dá)變化

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，孤獨(dú)癥模型組c-Myc及cyclin D1 mRNA表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

Figure 4. Expression of c-Myc (A) and cyclin D1 (B) mRNA in PFC and HF of control and autism rats.Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

討 論

為探討經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在孤獨(dú)癥發(fā)病中的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了孤獨(dú)癥模型大鼠PFC和HF腦區(qū)內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的活性變化。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，孤獨(dú)癥模型大鼠腦內(nèi)經(jīng)典Wnt通路的活性增強(qiáng)，基于GSK-3β mRNA減少，失活的GSK-3β磷酸化表達(dá)增加；β-catenin mRNA增加，抑制性的β-catenin磷酸化減少；下游c-Myc和cyclin D1 mRNA增加。這些結(jié)果提示經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活性增加可能是孤獨(dú)癥發(fā)病的原因之一，其活性增強(qiáng)可能促進(jìn)對(duì)孤獨(dú)癥的易感性。

研究顯示，影響個(gè)體發(fā)育的環(huán)境危險(xiǎn)因素與孤獨(dú)癥發(fā)病之間存在關(guān)聯(lián)。妊娠早期即在神經(jīng)管閉合時(shí)期VPA暴露大大增加子代罹患孤獨(dú)癥的風(fēng)險(xiǎn)。孤獨(dú)癥在個(gè)體發(fā)育早期表現(xiàn)為腦過度增長，這可能與參與胚胎發(fā)育調(diào)控的 Wnt 信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙有關(guān)[5]。

經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡、突觸的形成與聯(lián)系及胚胎的發(fā)育，參與孤獨(dú)癥的發(fā)生[3, 7]。但是，迄今為止，經(jīng)典的 Wnt信號(hào)通路如何參與孤獨(dú)癥發(fā)生的分子機(jī)制并不完全清楚。我們課題組以前研究結(jié)果顯示，VPA 暴露上調(diào)Wnt1 和 Wnt2表達(dá)，增加下游靶基因engrailed-1和 cyclin D1表達(dá)[3]。這可能與Wnt1和 Wnt2 表達(dá)增加激活經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，導(dǎo)致下游信號(hào)分子β-catenin表達(dá)增加，從而激活 Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VPA 暴露顯著減少抑制性的β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化水平，增加失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化水平，導(dǎo)致經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路活性增加。GSK-3β是β-catenin上游的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，參與磷酸化β-catenin，與β-catenin胞漿降解緊密相關(guān)， 故在孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)理中起著至關(guān)重要的作用[8]。GSK-3β受N 末端絲氨酸(Ser9)負(fù)性調(diào)節(jié)，磷酸化Ser9 則GSK-3β失活；相反，磷酸化其酪氨酸(Tyr216)則GSK-3β活性增加[9]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VPA暴露增加了失活的GSK-3β(Ser9)磷酸化，表現(xiàn)在 GSK-3β底物β-catenin表達(dá)增加，β-catenin 磷酸化減少。這一結(jié)果與以前的報(bào)道結(jié)果是一致的，即孤獨(dú)癥的發(fā)生與GSK-3β活性增強(qiáng)有關(guān)[8]。顯然，GSK-3β(Ser9)磷酸化增加、β-catenin(Ser33/37/Thr41)磷酸化減少表明經(jīng)典Wnt信號(hào)通路活性增加，暗示經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與孤獨(dú)癥的發(fā)生。我們前期結(jié)果顯示，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路特異性抑制劑舒林酸處理以后，傷害性知覺、重復(fù)刻板樣、學(xué)習(xí)記憶能力等孤獨(dú)癥樣行為均有所改善[5]，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了我們的推斷，即Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性增加促進(jìn)了對(duì)孤獨(dú)癥的易感性。

綜上所述，我們認(rèn)為，VPA暴露通過誘導(dǎo)腦組織Wnt/β-catenin通路活性增加，使腦內(nèi)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路功能增強(qiáng)，可能影響神經(jīng)元正常發(fā)育和聯(lián)系，阻礙了正常的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成，從而可能引起社會(huì)交往、情緒和語言等行為方面的異常，最終導(dǎo)致孤獨(dú)癥的發(fā)病。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Gu F, Chauhan V, Kaur K, et al. Alterations in mitochondrial DNA copy number and the activities of electron transport chain complexes and pyruvate dehydrogenase in the frontal cortex from subjects with autism[J]. Transl Psychiatry, 2013,3:e299.

[2] 李海英, 張 力, 潘歡樂, 等. Wnt信號(hào)通路在食管癌細(xì)胞放射抗拒性形成中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012,28(9):1623-1626.

[3] Wang Z, Xu L, Zhu X, et al. Demethylation of specific Wnt/beta-catenin pathway genes and its upregulation in rat brain induced by prenatal valproate exposure[J]. Anat Rec (Hoboken), 2010,293(11):1947-1953.

[4] Martin PM, Yang X, Robin N, et al. A rareWNT1 missense variant overrepresented in ASD leads to increased Wnt signal pathway activation[J]. Transl Psychiatry, 2013,3:e301.

[5] Zhang Y, Sun Y, Wang F, et al. Downregulating the canonical Wnt/beta-catenin signaling pathway attenuates the susceptibility to autism-like phenotypes by decreasing oxidative stress[J]. Neurochem Res, 2012,37(7):1409-1419.

[6] Schneider T, Turczak J, Przewlocki R. Environmental enrichment reverses behavioral alterations in rats prenatally exposed to valproic acid: issues for a therapeutic approach in autism[J]. Neuropsychopharmacology, 2006,31(1):36-46.

[7] Zhang A, Shen CH, Ma SY, et al. Altered expression of autism-associated genes in the brain of fragile X mouse model[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009,379(4):920-923.

[8] Mines MA, Yuskaitis CJ, King MK, et al. GSK3 influences social preference and anxiety-related behaviors during social interaction in a mouse model of fragile X syndrome and autism[J]. PLoS One, 2010,5(3):e9706.

[9] 張 彬, 李法琦. 糖原合酶激酶-3β信號(hào)分子在心肌肥厚中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010,26(3):601-604.