黃秋菊， 黃金賢， 羅佳妮， 劉培慶， 陳少銳， 潘雪刁， 臧林泉， 周四桂△

(1廣東藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，廣東 廣州 510006； 2中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實驗室，廣東 廣州 510006)

心肌是耗能最多的組織之一。哺乳動物胚胎期心臟主要以葡萄糖和乳酸作為能源，出生后則為以脂肪酸氧化為主；但在病理性心肌肥大時脂肪酸氧化降低，糖酵解增加，心肌能量代謝發(fā)生“胚胎型轉(zhuǎn)換”[1]。 長期運動訓(xùn)練可使心肌能量代謝水平與適應(yīng)能力提高，脂肪酸氧化能力增強[2]。深入探討生理性和病理性心肌肥大2種不同的狀態(tài)下心肌細(xì)胞的能量代謝特征，將有助于進(jìn)一步認(rèn)識生理性與病理性心肌肥大的區(qū)別。

短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(short-chain acyl-CoA dehydrogenase，SCAD) 是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員，特異性地分解短鏈脂酰輔酶A 底物，是脂肪酸β 氧化的第1個限速步驟，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)我們比較了16周齡自發(fā)性高血壓大鼠和血壓正常大鼠的心肌蛋白質(zhì)組，首次發(fā)現(xiàn)SCAD在自發(fā)性高血壓大鼠肥大心肌中的表達(dá)顯著降低[4]。我們進(jìn)一步證實生理性心肌肥大模型中SCAD mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，而病理性心肌肥大模型中SCAD mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，二者之間的表達(dá)具有顯著差異[5]，此外，我們采用體外苯腎上腺素(phenylephrine, PE)刺激誘導(dǎo)的病理性心肌細(xì)胞肥大模型中，SCAD在蛋白及mRNA水平上均顯著下調(diào)，進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)，觀察到SCADsiRNA干擾心肌細(xì)胞引起SCAD表達(dá)下調(diào)的同時，心肌細(xì)胞表面積明顯增大，心肌肥大標(biāo)志物心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor, ANF)和腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide, BNP)均明顯上升[6-7]，表明SCAD 表達(dá)失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

研究表明，心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα)表達(dá)的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員，也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。研究證實，與野生型小鼠相比，PPARα-/-小鼠心肌中SCAD蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，且心肌對脂肪酸攝取、氧化能力下降，表明SCAD基因的表達(dá)受PPARα調(diào)控[9]。研究報道，PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞病理性肥大模型中，激活的ERK1/2使PPARα的表達(dá)下調(diào),轉(zhuǎn)錄活性下降[10]。然而，研究表明，心臟生理性肥大時ERK1/2并無激活，與病理性心肌肥大的變化趨勢不一致[11]。

目前認(rèn)為，蛋白激酶C激活Raf-1，進(jìn)而激活有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activited protein kinase，MAPK)，MAPK信號通路(ERK1/2通路是其中之一)在心肌肥大中發(fā)揮著重要作用。然而MAPK信號通路在生理性和病理性心肌肥大中的作用尚未明確。本課題從心肌能量代謝的視角來探討生理性和病理性心肌肥大的發(fā)病機制，揭示生理性和病理性心肌肥大的分子調(diào)控機制的不同，豐富對心肌肥大發(fā)病機制的認(rèn)識，以期為預(yù)測生理性與病理性心肌肥大及其預(yù)后尋找新的分子標(biāo)志物，并為病理性心肌肥大的治療尋找新的靶點。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)

RT-PCR測定試劑盒(DRR420A)、TRIzol(9108)和SYBR Green(DRR420S)購于TaKaRa；BCA蛋白定量試劑盒(23225)、Western blotting發(fā)光液(34080)購于Thermo；細(xì)胞SCAD活性比色法定量檢測試劑盒購于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；游離脂肪酸測定試劑盒(A042)購于南京建成生物研究所；IGF-1(SRP4121)、PE(P6126)、 單克隆鼠抗PPARα和單克隆鼠抗α-tubulin購于Sigma；單克隆兔抗SCAD購于Abcam;單克隆兔抗p-ERK1/2和單克隆兔抗ERK1/2購于Cell Signaling Technology。

采用本實驗室已建立的乳鼠心肌細(xì)胞改良法分離并培養(yǎng)心細(xì)胞，取2～3 d SD 乳鼠(廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心) 用胰蛋白酶(Sigma) 冰上消化20 min 后，37 ℃水浴多次消化將乳鼠心臟消化成為單細(xì)胞懸液，在差速貼壁分離后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度種于培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并加入0.1 mmol/L BrdU(Sigma) 抑制成纖維細(xì)胞生長。按照上述方法分離制備的心肌細(xì)胞，經(jīng)α-actin 抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，純度可達(dá)95%以上，符合實驗要求。實驗分為：(1)對照組：正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞；(2)IGF-1組：加入IGF-1(10 nmol/L)作用24 h;(3)PE組：加入PE(10 μmol/L)作用24 h。

2 方法

2.1心肌細(xì)胞表面積的檢測 按照實驗分組處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞后用德國Zeiss(AX10)倒置熒光顯微鏡200倍攝像，各處理組隨機選取3次實驗的10個視野，每個視野約包含10個左右心肌細(xì)胞，測量100個心肌細(xì)胞的面積，以ImageJ圖像分析軟件分析結(jié)果。

2.2Real-time PCR檢測mRNA的表達(dá) 按照TRIzol(TaKaRa)說明書步驟提取細(xì)胞或組織總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA樣品的260 nm、280 nm波長下的A值，檢測純度并計算出RNA的濃度。參照TaKaRa有限公司RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)管放置于PCR儀(Thermo) 中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。兩步法進(jìn)行PCR擴增反應(yīng)，按照說明書加入熒光染料(TaKaRa)、序列和RT 產(chǎn)物后在real-time PCR儀(Bio-Rad IQ5)中進(jìn)行反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù): 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ (1個循環(huán))。具體引物序列見表1[由生工生物工程(上海)有限公司合成]。

表1 Real-time PCR擴增產(chǎn)物引物序列

2.3Western blotting法檢測蛋白表達(dá) 提取各組心肌細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑(Thermo)檢測細(xì)胞蛋白含量后調(diào)整上樣量，分裝、變性，配置10% SDS 分離膠和5% 濃縮膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜(Bio-Rad)，室溫封閉1 h 后加入Ⅰ抗(SCAD，1 ∶1 000；PPARα，1∶1 000；p-ERK1/2，1∶1 000；ERK1/2，1∶1 000；α-tubulin，1∶10 000)，過夜。漂洗后加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光試劑增強反應(yīng)，X 線壓片曝光、顯影、定影，結(jié)果采用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)對條帶進(jìn)行分析。

2.4SCAD活性檢測 按照實驗分組處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞后置于冰上裂解30 min，取上清液用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。酶活性檢測是基于2,6-二氯靛酚鈉(2,6-dichlorophenol indophenol, DCPIP)作為人工電子受體，替代黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)，在SCAD的作用下，由短鏈脂酰輔酶A提供電子，經(jīng)過硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate, PMS)的傳遞，被還原為無色產(chǎn)物，通過分光光度儀的峰值變化(600 nm 波長)，來定量分析SCAD的活性。嚴(yán)格按照說明書采用酶標(biāo)儀法進(jìn)行檢測。

2.5心肌細(xì)胞游離脂肪酸含量測定 游離脂肪酸含量檢測原理是游離脂肪酸能與銅離子結(jié)合形成脂肪酸的銅鹽而溶于氯仿中，其含量與游離脂肪酸含量成正比，用銅試劑測定其中銅離子的含量，即可推算出游離脂肪酸的含量。按照實驗分組處理細(xì)胞，收獲細(xì)胞后于冰上用手動勻漿器破碎細(xì)胞，取上清BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白。嚴(yán)格按照游離脂肪酸測定試劑盒(A042)說明書進(jìn)行檢測，根據(jù)吸光率計算游離脂肪酸含量[nmol/(g protein)]。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件處理，組間比較應(yīng)用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 各組心肌細(xì)胞表面積的變化

由圖1可見，與對照組相比，分別用PE和IGF-1刺激心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞的表面積均顯著增大，表明PE和IGF-1都能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生明顯肥大。

Figure 1. Surface area of neonatal rat cardiomyocytes.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

2 各組心肌細(xì)胞mRNA表達(dá)的變化

由圖2可見，與對照組相比，肥大標(biāo)志物ANF和BNP都明顯升高，病理性肥大標(biāo)志物α-骨骼肌肌動蛋白(α-skeletal actin, α-SkA)在PE刺激下明顯升高，而IGF-1刺激無明顯變化，與研究報道的結(jié)果一致[12-14]，這說明PE誘導(dǎo)的病理性肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性肥大模型建立成功。與對照組相比，在PE刺激的心肌細(xì)胞中PPARα和SCAD mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)，而IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中PPARα和SCAD mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)。PPARα和SCAD mRNA表達(dá)在2種不同心肌肥大模型中表現(xiàn)出明顯的不一致，表明生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展可能與PPARα和SCAD的表達(dá)失調(diào)有密切關(guān)系。

3 各組心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)的變化

由圖3可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細(xì)胞中PPARα和SCAD蛋白的表達(dá)顯著下降，IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中PPARα和SCAD蛋白的表達(dá)顯著上升，這一變化與PPARα和SCAD mRNA的表達(dá)變化一致。然而，與對照組相比，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)在PE刺激的心肌細(xì)胞中顯著增加，在IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中顯著下降。這表明PE可能通過刺激ERK1/2磷酸化激活抑制PPARα表達(dá)，從而抑制下游SCAD表達(dá)，引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生；而IGF-1刺激可能通過引起ERK1/2磷酸化受抑制，使PPARα表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)SCAD表達(dá)增加引發(fā)生理性心肌肥大。

Figure 2. Relative mRNA expression of ANF, BNP, α-SkA, PPARα and SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs control.

Figure 3. The protein expression of PPARα, SCAD and p-ERK1/2 in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.*P<0. 05, **P<0. 01 vs control.

4 各組心肌細(xì)胞SCAD的酶活性變化

由圖4可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細(xì)胞SCAD活性顯著減弱，而IGF-1刺激的心肌細(xì)胞SCAD活性顯著增強。各組心肌細(xì)胞的SCAD活性與其SCAD mRNA和蛋白表達(dá)變化趨勢一致。表明在2種不同的心肌肥大中，SCAD不僅在表達(dá)量上有不一致的變化，而且酶活性也存在不一致的結(jié)果。

5 各組心肌細(xì)胞游離脂肪酸含量的變化

由圖5可見，與對照組相比，PE刺激的心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量顯著升高，而IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量顯著降低。這表明PE刺激的心肌細(xì)胞中SCAD蛋白表達(dá)和酶活性減低導(dǎo)致了心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力降低，從而使心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量增加；而IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中SCAD蛋白表達(dá)和酶活性增加導(dǎo)致了心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力增強，從而使心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量下降。

Figure 4. The activity of SCAD in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

Figure 5. The content of free fatty acid in the myocardial cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control.

討 論

運動性心肌肥大本質(zhì)上是心臟對身體負(fù)荷的代償性機制, 是對運動訓(xùn)練的良好適應(yīng)性反應(yīng)，身體訓(xùn)練對于心臟的負(fù)荷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于因持續(xù)性和進(jìn)行性容量或壓力負(fù)荷過重等病理負(fù)荷對心臟的影響[15]。高血壓引起的病理性心肌肥大是心臟對急、慢性血流動力學(xué)超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是心臟為適應(yīng)長期的壓力或容量負(fù)荷而產(chǎn)生的代償性改變，是心力衰竭的前驅(qū)病變。越來越多的研究表明，病理性心肌肥大是臨床上多種心血管疾病發(fā)生率和死亡率增高的一個獨立危險因素[16]。因此，探討生理性與病理性心肌肥大的本質(zhì)區(qū)別，尋找防治病理性心肌肥大的潛在靶點，改善心臟功能，延緩其向心衰發(fā)展，對臨床心血管疾病治療有重要意義。

IGF-1作為一種媒介，參與心臟發(fā)育、心肌肥厚以及對肌肉體積、力量、身體成分的維持和營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)的重要作用。越來越多的證據(jù)表明，IGF-1在心血管系統(tǒng)中具有特殊作用。它可以促進(jìn)心肌生長，提高心肌收縮力、心輸出量、心室容積并且可以通過刺激收縮和抑制細(xì)胞凋亡來維持心臟功能[17]。在誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的因素中, 神經(jīng)體液因素是一類常見的原因, 其中腎上腺素受體及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是心肌細(xì)胞肥大的一個重要因素。本研究中，IGF-1和PE刺激的心肌細(xì)胞表面積與對照組相比均顯著增大。同時，在mRNA表達(dá)變化研究中，肥大標(biāo)志物ANF和BNP都明顯升高，而病理性肥大標(biāo)志物α-SkA在PE刺激下升高，而IGF-1刺激無明顯變化，與研究報道的結(jié)果一致[12-14]。這表明PE誘導(dǎo)的病理性心肌細(xì)胞肥大模型和IGF-1誘導(dǎo)的生理性心肌細(xì)胞肥大模型都建立成功。

SCAD是脂酰輔酶A 脫氫酶家族中的一員，是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶[3]。本研究中，IGF-1刺激的心肌細(xì)胞SCAD mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，而PE刺激的心肌細(xì)胞SCAD mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，兩者之間存在顯著差異，與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果一致[4]。這表明SCAD的表達(dá)失調(diào)可能與生理性和病理性心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系。同時，IGF-1刺激的心肌細(xì)胞SCAD活性明顯增強，游離脂肪酸含量顯著下降，表明IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中SCAD蛋白表達(dá)和酶活性增加可能導(dǎo)致了心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力增強，促進(jìn)了心肌細(xì)胞游離脂肪酸代謝，使心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量下降，從而達(dá)到心肌細(xì)胞能量代謝和功能增強的作用。而PE刺激的心肌細(xì)胞SCAD活性明顯減弱，游離脂肪酸含量顯著增高，表明PE刺激的心肌細(xì)胞中SCAD蛋白表達(dá)和酶活性下降可能導(dǎo)致了心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力減弱，使得心肌細(xì)胞對游離脂肪酸利用減少，使心肌細(xì)胞中游離脂肪酸含量增加，這種變化引起了心肌細(xì)胞能量代謝紊亂和結(jié)構(gòu)改變以及功能的降低。綜上所述，SCAD在2種不同的心肌肥大中具有顯著差異，提示SCAD可能成為區(qū)別生理性和病理性心肌肥大的分子標(biāo)志物，并且有可能成為病理性心肌肥大的潛在治療靶點。

心肌肥大發(fā)展過程中能量代謝底物的轉(zhuǎn)變與心肌PPARα表達(dá)的下降及失活有關(guān)[8]。PPARα是核受體超家族成員，也是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子。本研究中，IGF-1刺激的心肌細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，而PE刺激的心肌細(xì)胞PPARα mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，與SCAD mRNA和蛋白表達(dá)變化趨勢相一致。表明PPARα可能調(diào)控SCAD的表達(dá)，并且這種表達(dá)調(diào)控呈正相關(guān)性。有研究報道，PPARα為ERK1/2的下游作用靶點。同時，在本研究中，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)在IGF-1刺激的心肌細(xì)胞中顯著下降，在PE刺激的心肌細(xì)胞中顯著增高，而總ERK1/2在各組間無明顯變化。這表明ERK1/2可能在磷酸化激活后調(diào)控PPARα的表達(dá)，并且這種表達(dá)調(diào)控呈負(fù)相關(guān)性。

綜上所述， IGF-1可能通過刺激心肌細(xì)胞中ERK1/2磷酸化受抑制，從而使PPARα表達(dá)增加，進(jìn)一步使SCAD表達(dá)和酶活性增加，促使心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力增強，導(dǎo)致生理性心肌肥大；而PE可能通過刺激心肌細(xì)胞中ERK1/2磷酸化激活后，從而抑制PPARα表達(dá)，進(jìn)一步使SCAD表達(dá)和酶活性降低，導(dǎo)致了心肌細(xì)胞脂肪酸β氧化能力減弱，引發(fā)病理性心肌肥大的發(fā)生。本研究揭示了生理性和病理性心肌肥大的分子機制調(diào)控的不同，豐富了對心肌肥大機制的認(rèn)識。然而，SCAD作為生理性和病理性心肌肥大的分子標(biāo)志物和病理性心肌肥大的作用靶點的可能仍需要更深入的研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Kolwicz SC Jr, Tian R. Glucose metabolism and cardiac hypertrophy[J]. Cardiovasc Res，2011, 90(2):194-201．

[2] Foryst-Ludwig A, Kreissl MC, Sprang C, et al. Sex differences in physiological cardiac hypertrophy are asso-ciated with exercise-mediated changes in energy substrate availability[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2011, 301(1):H115-H122．

[3] Pena L, Angle B, Burton B, et al. Follow-up of patients with short-chain acyl-CoA dehydrogenase and isobutyryl-CoA dehydrogenase deficiencies identified through newborn screening: one center’s experience[J]. Genet Med, 2012, 14(3):342-347．

[4] Zhou SG, Zhou SF, Huang HQ, et al. Proteomic analysis of hypertrophied myocardial protein patterns in renovascularly hypertensive and spontaneously hypertensive rats[J]．J Proteome Res, 2006, 5(11):2901-2908．

[5] 周四桂，王 平，路 遙，等. 短鏈?；o酶A脫氫酶在大鼠生理性和病理性心肌肥大中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(11):1921-1927.

[6] 羅佳妮，周四桂，陳少銳，等. 短鏈脂酰輔酶A脫氫酶與心肌肥大關(guān)系的初步探索[J].中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(5):673-642.

[7] 黃金賢，羅佳妮，劉培慶，等. AMPK/PPARα/SCAD信號途徑對心肌肥大的調(diào)控研究[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(5):769-778.

[8] Smeets PJ, Teunissen BE, Willemsen PH, et al. Cardiac hypertrophy is enhanced in PPARα-/-mice in response to chronic pressure overload[J]. Cardiovasc Res, 2008, 78(1):79-89.

[9] Watanabe K, Fujii H, Takahashi T, et al. Constitutive regulation of cardiac fatty acid metabolism through peroxisome proliferator-activated receptor alpha associated with age-dependent cardiac toxicity[J]. J Biol Chem, 2000, 275(29):22293-22299.

[10] Meng R, Pei Z, Zhang A, et al. AMPK activation enhances PPARα activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway[J]. Arch Biochem Biophys, 2011, 511(1-2):1-7.

[11] Gosslesin H, Béliveau L, Burelle Y, et al. Disparate regulation of signaling proteins after exercise and myocardial infarction[J]. Med Sci Sports Exercise, 2006， 38(3):455-462.

[12] Arantes LA, Aguiar CJ, Amaya MJ, et al. Nuclear inositol 1,4,5-trisphosphate is a necessary and conserved signal for the induction of both pathological and physiological cardiomyocyte hypertrophy[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 53(4):475-486.

[13] Bhavsar PK, Brand NJ, Felkin LE, et al. Clenbuterol induces cardiac myocyte hypertrophy via paracrine signalling and fibroblast-derived IGF-1[J]. J Cardiovasc Transl Res, 2010, 3(6):688-695.

[14] Kong SW, Bodyak N, Yue P, et al. Genetic expression profiles during physiological and pathological cardiac hypertrophy and heart failure in rats[J]. Physiol Genomics, 2005, 21(1):34-42.

[15] 常 蕓. 運動性與病理性心肌肥大[J]. 中國運動醫(yī)學(xué)雜志, 1989, 8(1):35-37.

[16] Takasaki K，Miyata M，Imamura M，et al． Left ventricular dysfunction assessed by cardiac time interval analysis among different geometric patterns in untreated hypertension[J]． Circ J, 2012, 76(6):1409-1414．

[17] Sell C, Baserga R, Rubin R. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and the IGF-1 receptor prevent etoposide-ieduced apoptosis[J]. Cancer Res, 1995, 55(2):303-306.