黃永輝，程保平，彭埃天，宋曉兵，凌金鋒，陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣州 510640)

廣東不同地區(qū)柑橘黃龍病菌的遺傳多樣性分析

黃永輝，程保平，彭埃天*，宋曉兵，凌金鋒，陳 霞

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實驗室，廣州 510640)

不同基因型的黃龍病菌可能具有不同的致病模式，為了探明廣東省不同基因型黃龍病菌的分布特點(diǎn)，為該病害的流行學(xué)研究提供重要依據(jù)，本研究利用PCR-RFLP的方法研究了廣東省柑橘產(chǎn)區(qū)7個市縣黃龍病菌外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)基因的遺傳多樣性，并對各地黃龍病菌的omp基因進(jìn)行克隆測序，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。采用4種限制性內(nèi)切酶消化各地區(qū)的柑橘黃龍病菌omp基因分別產(chǎn)生了不同的RFLP指紋圖譜，每種限制性內(nèi)切酶均產(chǎn)生了2種類型的酶切譜帶；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示：廣東地區(qū)的柑橘黃龍病菌屬于韌皮部桿菌亞洲種，且親緣關(guān)系非常近。廣東地區(qū)黃龍病菌在omp基因水平上未見顯著差異，未發(fā)現(xiàn)其他優(yōu)勢種類。

柑橘黃龍病菌；omp； RFLP； 遺傳多樣性

柑橘黃龍病(citrus Huanglongbing，簡稱HLB)是一種世界性的柑橘病害，在我國及東南亞、非洲、阿拉伯半島、印度、巴西和美國佛羅里達(dá)州等地區(qū)均有發(fā)生[1]，嚴(yán)重制約著柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

柑橘黃龍病的病原過去曾一度被認(rèn)為是類菌原體或類立克次氏體，但Garnier在1984年發(fā)現(xiàn)黃龍病病原的膜結(jié)構(gòu)外壁和內(nèi)壁間存在著肽聚糖層，這與革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)非常相似，因此認(rèn)為黃龍病的病原是一種革蘭氏陰性細(xì)菌[2]。普遍認(rèn)為該病原屬于韌皮部桿菌屬，有亞洲種、非洲種和美洲種3個種[3]。目前在我國僅發(fā)現(xiàn)有亞洲種[4]，該病菌主要由接穗、苗木和柑橘木虱傳播。該病原菌易于傳播的特性使其分布范圍較廣[5]。 而近期在多種植物病原菌的研究中發(fā)現(xiàn)：病原菌可能會針對不同地域進(jìn)化出不同的適生基因型，因此檢測廣東省黃龍病菌不同的基因型并分析其地域分布規(guī)律對該菌的流行病學(xué)研究有著重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)：來自不同地區(qū)的黃龍病菌存在多種不同的血清型，用采自不同地區(qū)的黃龍病菌制備的單克隆抗體對不同黃龍病菌株表現(xiàn)出不同的專一性[6]。說明來自不同地域的黃龍病菌，存在一定的差異。但用血清型來區(qū)分不同的黃龍病菌多樣性非常繁瑣，用基因多態(tài)性來區(qū)分其多樣性是更為經(jīng)濟(jì)簡便的選擇。前人已證實：16S rDNA和核糖體蛋白基因由于太保守，難以用于區(qū)分來自不同地域的柑橘黃龍病菌的基因多態(tài)性[7]，而最近的研究發(fā)現(xiàn)一種外膜基因omp對多種微生物的種內(nèi)基因多態(tài)性均能很好地區(qū)分，對來自不同地域黃龍病菌的基因多態(tài)性亦可區(qū)分[6, 8]。王中康等也利用該菌的omp基因探索了中國6個省份亞洲韌皮部桿菌的遺傳多樣性，但對廣東省內(nèi)不同地區(qū)的亞洲韌皮部桿菌的遺傳多樣性尚需進(jìn)一步明確和補(bǔ)充[9]。PCR-RFLP技術(shù)簡單、直觀、可靠，因此本研究利用該技術(shù)和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對廣東省7個市縣的柑橘黃龍病菌omp基因進(jìn)行研究和分析，旨在探明廣東省不同地理區(qū)域柑橘黃龍病菌的遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在廣東省內(nèi)的7個市縣采集感染了柑橘黃龍病菌的6個柑橘品種的樣品材料，分別為采自廣州市從化的‘馬水橘’葉片、惠州市龍門的‘年橘’葉片、揭陽市揭東的‘椪柑’葉片、普寧市里湖的‘蕉柑’葉片、普寧市云落的‘蕉柑’葉片、肇慶市德慶的‘貢柑’葉片和肇慶市高要的‘砂糖橘’葉片。

1.2 樣品總DNA提取

以“裂解-過濾法”提取樣品總DNA，參考Wang等的方法[10]。具體操作步驟：稱取0.2 g柑橘葉片中脈于研缽中，加入少量石英砂后用液氮研磨成粉末，加入350 μL PBS緩沖液及0.9 μL RNA酶，研磨30 s；轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，加入150 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，渦旋振蕩混合均勻，于56 ℃水浴10 min；加入350 μL蛋白去除液，渦旋振蕩混合均勻，于12 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移到DNA過濾柱(Axygen)中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；用500 μL洗滌液洗滌1次，再用700 μL脫鹽液洗滌2次；在過濾柱中加入100 μL預(yù)熱的2.5 mmol/L Tris-HCl或ddH2O室溫靜置1 min，12 000 r/min離心1 min，所得溶液即為樣品總DNA溶液。

1.3 目的基因的PCR擴(kuò)增

分別以不同來源的樣品DNA為模板，以上游引物omp5：GATGATAGGTGCATAAAAG TACAGAAG和下游引物omp3：AATACCCTTATGGGATACAAAAA[6]擴(kuò)增黃龍病菌外膜蛋白o(hù)mp基因。PCR反應(yīng)體系為：Ex Taq-Mix DNA聚合酶25 μL(含dNTP)，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，DNA模板2 μL，無菌水補(bǔ)足至總體積50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃1 min，72 ℃ 3 min，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 目的基因的克隆、測序及RFLP分析

將PCR產(chǎn)物上樣于含有Goldview染料的瓊脂糖凝膠中電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。將瓊脂糖凝膠上的目的條帶切割回收，用凝膠回收試劑盒(Axygen)回收純化，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

將回收純化的目的片段與pMD19-T克隆載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp抗生素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)后挑取平板上的單克隆菌落，用引物omp5和omp3進(jìn)行菌落PCR鑒定。對于每個轉(zhuǎn)化子挑選3個經(jīng)鑒定為陽性的克隆，送交生物公司進(jìn)行雙向測序。

序列用BioEdit軟件分析(http:∥www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)，找出各樣品間omp基因序列的堿基差異位點(diǎn)以及對應(yīng)的內(nèi)切酶位點(diǎn)，該軟件能自動計算出可區(qū)分各樣品中omp基因序列差異的內(nèi)切酶。陽性克隆重組子用質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen)抽提后，質(zhì)粒經(jīng)電泳驗證為單一目的重組質(zhì)粒，然后分別用限制性內(nèi)切酶BspCNⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ和ClaⅠ在各自適宜的溫度下進(jìn)行酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離后，進(jìn)行RFLP指紋圖譜分析。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用NCBI中的Blast工具對所測序列進(jìn)行比對，分析其與數(shù)據(jù)庫中已有的柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因序列的同源性。對廣東省7個市縣樣品的外膜蛋白基因核苷酸序列和氨基酸序列通過生物學(xué)軟件DNAman進(jìn)行多重比對，比較不同地區(qū)樣品間基因的堿基差異和氨基酸差異。為了便于全面分析，除了采用本研究中7個柑橘黃龍病樣品的基因序列外，另選取了數(shù)據(jù)庫中其他國家和地區(qū)的柑橘黃龍病菌亞洲種的外膜蛋白基因序列一并用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中本研究獲得的7個菌株序列為：Guangdong-CH (KC473155)、Guangdong-LM (KC473156)、Guangdong-JD (KC473157)、Guangdong-LH (KC473158)、Guangdong-YL (KC473159)、Guangdong-DQ (KC473160)、Guangdong-GY (KC473161)。選取的數(shù)據(jù)庫中其他菌株有：China-Beihai (AY842429)、Taiwan(AB480106)、Thailand-Nakhompathom (AY842432)、Japan(AB480103)、Indonesia(AB480132)，以及柑橘黃龍病菌非洲種的外膜蛋白基因序列South Africa-Nelspruit(AY642158)，另外，其他一些α變形菌綱細(xì)菌Sinorhizobiummeliloti(NP385608)和Bartonellahenselae(AAL66374)，β變形菌綱的BetaproteobacteriumKB13(EDZ64793)，以及γ變形菌綱Escherichiacoli(NP_285871)的外膜蛋白基因序列也被采用。先用Cluxtal X軟件對上述基因序列進(jìn)行多重比對，然后利用MEGA軟件的最大簡約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置自舉檢驗重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 外膜蛋白基因的擴(kuò)增

以omp5/omp3為引物，從感染柑橘黃龍病菌的廣州市從化的‘馬水橘’葉片、惠州市龍門的‘年橘’葉片、揭陽市揭東的‘椪柑’葉片、普寧市里湖的‘蕉柑’葉片、普寧市云落的‘蕉柑’葉片、肇慶市德慶的‘貢柑’葉片和肇慶市高要的‘砂糖橘’葉片材料中均可擴(kuò)增獲得大小為2 300 bp左右的條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致。

圖1 柑橘黃龍病菌外膜蛋白o(hù)mp基因的PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products of omp gene

2.2 PCR產(chǎn)物的RFLP分析

對廣東省7個不同地區(qū)的柑橘樣品黃龍病菌外膜蛋白基因，用選取的4個內(nèi)切酶進(jìn)行消化，酶切圖譜均得到2種類型的譜帶，其中BspCNⅠ酶切產(chǎn)物產(chǎn)生的電泳譜帶，廣州市從化樣品有別于其他地區(qū)(圖2-a)；NdeⅠ酶切產(chǎn)物的電泳譜帶，惠州市龍門樣品不同于其他地區(qū)(圖2-b)；BamHⅠ和ClaⅠ的酶切產(chǎn)物電泳譜帶分別是肇慶市德慶和高要的樣品與其他樣品有差異(圖2-c和d)。以上結(jié)果初步表明廣東省不同地區(qū)的柑橘黃龍病菌之間存在一定的遺傳多樣性。

2.3 外膜蛋白基因的序列分析

用BioEdit軟件對廣東省7個市縣的柑橘黃龍病菌外膜蛋白o(hù)mp的核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果表明各地區(qū)的外膜蛋白核苷酸序列均存在一定的差異，氨基酸序列除廣州市從化地區(qū)和普寧市里湖地區(qū)的樣品完全一致外，其余也都存在差異，詳見表1和表2。

測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的黃龍病菌外膜蛋白o(hù)mp基因的核苷酸序列全長為2 346 bp，對其進(jìn)行Blast多重比對分析發(fā)現(xiàn)，本試驗中7個樣品外膜蛋白基因的核苷酸序列與數(shù)據(jù)庫中其他地區(qū)柑橘黃龍病菌亞洲種的外膜蛋白基因核苷酸序列的相似性均達(dá)到99%，與非洲種外膜蛋白基因核苷酸序列的相似性為72%左右。由外膜蛋白基因核苷酸序列推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，本研究所得到的外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列與其他地區(qū)亞洲種黃龍病菌外膜蛋白基因所編碼的氨基酸序列相似性也達(dá)到99%，與非洲種外膜蛋白基因編碼的氨基酸序列相似性僅為59%左右。

圖2 柑橘黃龍病菌外膜蛋白基因的RFLP圖譜Fig.2 Restrictive endonuclease polymorphisms of omp gene of Candidatus Liberibacter asiaticus

表1 不同地區(qū)之間樣品外膜蛋白基因的堿基差異Table 1 Base differences among omp genes derived from samples collected from different regions

表2不同地區(qū)之間樣品外膜蛋白基因的氨基酸差異

Table2Differencesofaminoacidamongompgenesfromdifferentregions

地區(qū)Region氨基酸位點(diǎn)Aminoacidsite1251411852222754375581NATGFEK2NAAGLKK3NATGFKK4NATGFEK5NVTGFKK6NATSFEK

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于柑橘黃龍病菌omp基因序列采用最大簡約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，廣東省7個不同地區(qū)的黃龍病菌株和α變形菌綱聚于一類，均屬于韌皮部桿菌亞洲種，和已報道的中國北海及泰國的亞洲種菌株的親緣關(guān)系非常近，在進(jìn)化樹上難以區(qū)分。但是與我國臺灣、日本和印尼的菌株卻有較大差異。因此推斷，廣東地區(qū)的亞洲韌皮部桿菌具有很高的同源性，同時也存在一定的遺傳變異。

圖3 基于omp基因構(gòu)建的柑橘黃龍病菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Candidatus Liberibacter asiaticus base on omp gene

3 討論

柑橘黃龍病是目前柑橘產(chǎn)業(yè)的最大威脅，該病原菌寄主繁多[11-12]，其在不同的寄主品種中可能存在不同的適生基因型，因此分析廣東省黃龍病菌不同的基因型并檢測其地域性分布規(guī)律對該病菌的流行病學(xué)研究有著重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病菌存在豐富的遺傳多樣性[6,9]，廣東省是中國柑橘主產(chǎn)區(qū)，也是受黃龍病危害最為嚴(yán)重的地區(qū)，但該省各地區(qū)柑橘黃龍病菌的遺傳多樣性卻較少被研究。

本文系統(tǒng)分析了廣東省柑橘主產(chǎn)區(qū)柑橘黃龍病菌的遺傳多態(tài)性，研究表明廣東省的柑橘黃龍病菌具有較為豐富的遺傳多態(tài)性。這一研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似[9,13-14]，前人分析了各地區(qū)的一些黃龍病菌菌株，也顯示出豐富的多態(tài)性，這就表明不同地域的黃龍病菌都具有一定的序列變異度。從系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果來看，黃龍病菌類群的劃分與菌株的地理來源存在一定的相關(guān)性，說明各地病原菌存在一定的親緣關(guān)系，但同時也存在一定的遺傳變異，基因組的變化最終可能反映在菌株的生理和毒力變化方面，這就警示我們要注意監(jiān)控廣東省黃龍病菌的變種情況。因此，黃龍病菌株的致病性與菌株相互間遺傳親疏的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。

序列及系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，廣東省的柑橘黃龍病菌屬于亞洲種，與黃龍病菌非洲種有一定的序列差異，可能暗示著這兩類菌株的致病力和寄主范圍有一定差異，這就需要對其他國家的黃龍病菌進(jìn)行及時檢驗檢疫，以免不同的致病種傳入廣東省，造成更大的危害。

此外，omp基因已被證實可作為細(xì)菌生物多樣性研究的一個很有潛力的候選基因[6,13]，本研究在分析了廣東省柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的基礎(chǔ)上，還深入分析了其omp基因的其他相關(guān)信息，為今后開發(fā)黃龍病菌omp抗體技術(shù)打下堅實的基礎(chǔ)，對制定科學(xué)有效的黃龍病防治策略具有重要的指導(dǎo)意義。

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GeneticdiversityofCandidatusLiberibacterisolatesfromdifferentgeographicalregionsofGuangdongProvince

Huang Yonghui,Cheng Baoping,Peng Aitian,Song Xiaobing,Ling Jinfeng,Chen Xia

(InstituteofPlantProtection,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,Guangzhou510640,China)

Huanglongbing (HLB) is a destructive disease on citrus, and pathogens with different genotypes may possess different pathogenicity.Ascertain the distribution ofCandidatusLiberibacter asiaticus with different genotypes in Guangdong Province could provide an important basis for the studies of disease epidemics.In this study, PCR-RFLP analysis based on the outer membrane protein gene (omp) was conducted with disease samples from different regions.Theseompsequences were further sequenced and phylogenetic tree was constructed.The amplifiedompgenes ofCa.Liberibacter asiaticus were digested with four different restrictive endonucleases and several different gene polymorphisms were produced.Each restrictive endonuclease generated two types of DNA bands, and the pathogen isolates from Guangdong Province all belonged toCa.Liberibacter asiaticus.There existed no obvious distribution feature among HLB pathogens with different genotypes, suggesting that there were no dominant species of HLB pathogen in Guangdong Province.

CandidatusLiberibacter asiaticus;omp; RFLP; genetic diversity

2013-05-13

： 2013-09-17

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(粵農(nóng)[2009]380號); 廣東省農(nóng)業(yè)科技推廣重大技術(shù)研究項目(201201127);廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項目(201305)

S 436.66；S 432.4

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.010

* 通信作者 E-mail:pengait@163.com