徐 鳳，楊德亮，楊 杰，劉 秀，張 闖，吳明根

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000)

地黃對百草枯解毒機(jī)理的研究

徐 鳳，楊德亮，楊 杰，劉 秀，張 闖，吳明根*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000)

地黃對百草枯表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，百草枯分別處理300 g/hm2或600 g/hm2時(shí)，藥害等級分別為0級和2級，且藥害癥狀恢復(fù)較快。研究結(jié)果表明，地黃塊根、葉片乙醇提取物的DPPH自由基清除率隨著提取物濃度的增加而增高；葉片對DPPH自由基的清除效果好于塊根，DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需的地黃塊根、葉片乙醇提取物濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L。可以推測，地黃對百草枯的解毒是因?yàn)轶w內(nèi)含有抗氧化活性物質(zhì)，這種物質(zhì)遇到百草枯時(shí)能夠解除百草枯活性氧毒性，起到地黃對百草枯的解毒作用。

地黃； 百草枯； 抗氧化

地黃(RehmanniaglutinosaLibosch.)為玄參科地黃屬植物，是一種傳統(tǒng)的中藥植物資源。具有較強(qiáng)的抗氧化性，目前地黃規(guī)模化栽培中遇到除草難或除草劑殘留問題。

百草枯(paraquat)屬于高氧化活性的滅生性除草劑，在土壤中易失去活性，無殘留[1]。已有研究表明適量百草枯處理對地黃的生長和產(chǎn)量沒有顯著影響，因此可作為地黃田的特用除草劑[2-3]。研究顯示，地黃同科的玄參科多數(shù)植物提取物-梓醇、毛蕊花糖苷、多糖等具有清除DPPH自由基能力的抗氧化特性[4-6]。

植物對氧化性除草劑百草枯的耐性機(jī)理大體分為兩種類型，一是由植物結(jié)構(gòu)特異而產(chǎn)生對百草枯體內(nèi)吸收、傳導(dǎo)的障礙性，二是由植物體內(nèi)含有的抗氧化物質(zhì)而產(chǎn)生的對百草枯氧化性的解毒作用。但目前為止，地黃對百草枯的耐性機(jī)理尚不清楚，對此，本文通過對地黃對百草枯解毒機(jī)理的研究，為使用高效、低殘留百草枯除草劑防除地黃地雜草提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

地黃[RehmanniaglutinosaLibosch.]：河北省引種品種(代號85-5)。大豆品種：‘黑農(nóng)48’。

1.1.2 供試除草劑與試劑

百草枯:由先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司提供。二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH):由日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社提供，亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、95%乙醇、99.5%乙醚均為分析純。

1.1.3 供試儀器

UV-1700 PharmaSpec型分光光度計(jì)，CPA 324S型電子天平，EYEL4型減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SI500型軌道振蕩箱，多功能粉碎機(jī)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 地黃對百草枯的耐性鑒定

地黃出苗后20 d進(jìn)行百草枯田間莖葉處理，劑量分別為300、600 g/hm2，噴水處理設(shè)為對照。各處理重復(fù)3次，小區(qū)面積0.01 hm2。施藥后第10、20天和40天分別調(diào)查藥害癥狀。

1.2.2 地黃提取物對百草枯的解毒性測定

將20%百草枯1 mL與不同量的地黃塊根提取液(1.2.3中的地黃樣品待測液)混合，加水定容100 mL，利用微型噴霧器均勻噴灑到2個(gè)復(fù)葉長出的大豆葉片上，施藥后第20天分別調(diào)查藥害癥狀。

1.2.3 地黃提取物清除DPPH自由基能力測定

DPPH貯備液的配制：稱取DPPH試劑0.128 8 g，用95%乙醇溶解、定容500 mL，得到質(zhì)量濃度為257.7 mg/L 的DPPH貯備液(約6.5×10-4mol/L)備用[7]。

地黃提取、待測液的配制：將鮮地黃塊根(10月18日取樣)和葉片(7月9日取樣)在烘干箱中60 ℃烘干72 h后進(jìn)行粉碎過篩(40目)，稱取過篩根葉各10 g,分別以蒸餾水、80%乙醇溶劑靜置浸24 h,然后在30 ℃、15 000 r/min條件下的振蕩器中振蕩24 h，過濾，將提取液減壓蒸發(fā)濃縮，定容待測。

清除DPPH自由基能力的測定: 將DPPH貯備液用95%乙醇稀釋至質(zhì)量濃度為51.54 mg/L使用。在試管中依次加入2.0 mL 51.54 mg/L DPPH 溶液和2.0 mL樣品提取、稀釋溶劑(80%乙醇)，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為A0；在試管中依次加入DPPH 溶液的溶劑(95%乙醇)和2.0 mL待測試液，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為Ar；在試管中依次加入2.0 mL 51.54 mg/L DPPH溶液和2.0 mL待測試液，總體積為4.0 mL,搖勻后，在513 nm波長處測吸光值(A)，記為As。

按式(1)計(jì)算自由基清除率(Y)。

Y=1-(As-Ar)/A0

(1)

將待測地黃提取液配制成系列溶液，測定其DPPH自由基清除率，并繪制DPPH自由基清除率的提取液濃度曲線，用方程計(jì)算出當(dāng)DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需的提取液濃度(地黃材料重量/提取液體積)。

2 結(jié)果與分析

2.1 百草枯除草劑處理對地黃、大豆的藥害觀察

百草枯處理后調(diào)查藥害癥狀、等級結(jié)果(表1)，高劑量百草枯莖葉處理初期出現(xiàn)葉邊緣枯萎的藥害癥狀，藥害等級相當(dāng)于2級(0～10級分類法[8])，第20天后藥害癥狀消失，恢復(fù)正常生長。當(dāng)百草枯與地黃塊根提取液混合處理大豆幼苗時(shí)，地黃提取液表現(xiàn)解毒百草枯活性氧的抗氧化特性(表2)。因此認(rèn)為，地黃植株體內(nèi)含有抗氧化活性物質(zhì)，這種物質(zhì)遇到百草枯時(shí)能夠解除百草枯活性氧毒性。

表1地黃生長期百草枯處理的藥害癥狀及等級

Table1ThephytotoxicitysymptomsandgradeofR.glutinosaingrouingperiodbyparaquat

處理劑量/g·hm-2Dosage藥害等級(0～10級)Gradeofphytotoxicity(0～10)10d20d40d癥狀Phytotoxicitysymptom300000無600200葉邊緣，葉尖枯萎

表2百草枯和地黃塊根提取液混合處理的大豆葉片的藥害癥狀

Table2Thephytotoxicitysymptomsofsoybeanleavestreatedwithparaquatmixedwithrehmanniarootextracts

地黃塊根提取液/mLRehmanniarootextract百草枯/mLParaquat00．10葉片正常葉片全部枯死3葉片正常葉片大面積枯萎30葉片正常葉片少許枯黃100葉片正常葉片正常

2.2 DPPH吸光值與濃度關(guān)系

將257.7 mg/L DPPH貯備液用95%乙醇稀釋配成濃度梯度為206.16、103.08、51.54、41.23、20.62和10.31 mg/L的DPPH溶液，測吸光值(A)[9]。以吸光值(A)對DPPH濃度(C)作圖，得到Y(jié)(A)與X(C)的線性關(guān)系方程(圖1)。

圖1 DPPH濃度和吸光度的線性關(guān)系Fig.1 Linearity correlation between DPPH concentration and absorbency

2.3 地黃塊根、葉片提取液清除DPPH自由基的效果

測定結(jié)果(圖2)表明，地黃塊根、葉片提取物的DPPH自由基清除率都隨著提取物濃度的增加而增高；利用方程式計(jì)算DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需的提取液濃度，地黃塊根、葉片提取物濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L,說明地黃葉片清除DPPH自由基的效果好于塊根。

圖2 地黃塊根(a)和葉片(b)提取液濃度與DPPH清除率的線性關(guān)系Fig.2 Linearity correlation between ethanol extracts of rehmannia fresh roots and leaves and DPPH clearance rate

3 討論與結(jié)論

除草難嚴(yán)重阻礙長白山區(qū)藥用植物大規(guī)模栽培[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，河北省引種的適宜延邊地區(qū)栽培的地黃品種(代號85-5)對除草劑百草枯具有較強(qiáng)的耐藥性，在推薦使用劑量(300～400 g/hm2)范圍內(nèi)使用時(shí)對地黃無藥害癥狀。

通過觀察DPPH溶液在280～600 nm波長區(qū)間的掃描光譜，得到兩個(gè)特征吸收峰(329.5 nm)和(513 nm)，加入抗氧化劑抗壞血酸兩個(gè)吸收峰都降低，且513 nm處降低較顯著，故選用可見光513 nm處吸收峰的變化來表示DPPH含量的變化，用以評價(jià)地黃提取物的清除DPPH自由基抗氧化能力，這與陳叢瑾[7]等和Larrauri[11]等報(bào)道的DPPH吸收峰在517 nm略有差異。DPPH穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果吸光值A(chǔ)值在最初20 min內(nèi)下降較快，在20～40 min內(nèi)，反應(yīng)體系的A值變化緩慢，45 min后A值基本保持不變。因此測定時(shí)間為DPPH與提取物反應(yīng)后的50 min。測定結(jié)果，地黃塊根、葉片乙醇提取物的DPPH自由基清除率都隨著提取物濃度的增加而增高；葉片對DPPH自由基清除效果好于塊根，DPPH自由基清除率為50%時(shí)所需的提取液濃度分別為20.0 g/L和12.2 g/L。

以上研究結(jié)果說明，地黃植株體內(nèi)含有抗氧化活性物質(zhì)，這種物質(zhì)遇到百草枯時(shí)能夠解除百草枯活性氧毒性，從而起到對百草枯的解毒作用。

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DetoxicationmechanismofRehmanniaglutinosatoparaquat

Xu Feng，Yang Deliang，Yang Jie，Liu Xiu，Zhang Chuang，Wu Minggen

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity，Yanji133000,China)

Rehmanniaglutinosashowed tolerance to paraquat.The phytotoxicity ofR.glutinosawas grade 0 and grade 2 with paraquat at 300 g/hm2or 600 g/hm2, respectively.The results showed that the DPPH free radical scavenging activity of ethanol extract fromR.glutinosaroot tubers and leaves increased with the extractive concentration adding; the DPPH scavenging effect in the leaves was better than that in the root tubers.The concentrations ofR.glutinosaroot tubers and leaves extracted with ethanol were 20.0 g/L and 12.2 g/L, respectively, when the DPPH free radical scavenging activity was 50%.In general, the detoxication ofR.glutinosato paraquat was caused by the antioxidant substance which could remove paraquat reactive oxygen toxicity.

Rehmanniaglutinosa； paraquat； antioxidant

2013-01-21

： 2013-04-07

國家自然科學(xué)基金(31160370)

S 481.4

： ADOI： 10.3969/j.issn.0529-1542.2014.01.026

* 通信作者 Tel:0433-2435566; E-mail：5minggen@163.com