雒富春， 袁慶華， 王 瑜， 沈慧敏*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

苜蓿銹菌夏孢子的生物學(xué)特性及殺菌劑對其室內(nèi)毒力測定

雒富春1， 袁慶華2*， 王 瑜2， 沈慧敏1*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

采用孢子萌發(fā)法對引起苜蓿銹病的病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，并采用不同的殺菌劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定。研究表明：在100%相對濕度下，苜蓿銹菌夏孢子在5～30 ℃都能萌發(fā)，但溫度在20～25 ℃萌發(fā)最快；光照和1%葡萄糖液有促進(jìn)孢子萌發(fā)的作用；不同殺菌劑室內(nèi)毒力測定研究表明，吡唑醚菌酯和嘧菌酯效果最好，其EC50分別為0.040 1、0.068 1 mg/L。

苜蓿銹??； 生物學(xué)特性； 殺菌劑； 毒力測定

苜蓿是世界分布最廣泛的牧草，號稱“牧草之王”[1-2]，不僅產(chǎn)量高，而且草質(zhì)優(yōu)良，為各種畜禽所喜食[3]。隨著苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，苜蓿種植面積不斷擴(kuò)大，苜蓿病害問題越來越嚴(yán)重，特別是苜蓿銹病(alfalfa rust)在我國的東北、內(nèi)蒙古、河北、甘肅和新疆等地區(qū)發(fā)生和危害較為嚴(yán)重，對苜蓿生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

苜蓿銹病是由苜蓿銹菌(UromycesstriatusSchroet)引起的[6-7]，目前有關(guān)該菌的生物學(xué)特性、致病力及殺菌劑對其夏孢子的影響的報(bào)道較少[8]。因此，本文通過研究引起苜蓿銹病的夏孢子的生物學(xué)特性及不同殺菌劑對其室內(nèi)毒力測定，篩選對銹菌夏孢子敏感的抑孢殺菌劑，為苜蓿銹病的發(fā)生規(guī)律研究和化學(xué)防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿銹菌夏孢子生物學(xué)特性

1.1.1 供試菌種及來源

供試菌種：2012年秋采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廊坊牧草試驗(yàn)基地。

將采集到的帶有苜蓿銹菌的新鮮葉片用0.1%吐溫水溶液清洗，配制成在低倍鏡下觀察每視野40～60個(gè)夏孢子的懸浮液備用。

1.1.2 溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

采用水瓊脂玻片法[9]研究不同溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響。設(shè)置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7個(gè)溫度處理，將帶有銹菌夏孢子的水瓊脂玻片置入帶有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，然后放入可控溫度氣候培養(yǎng)箱，每個(gè)處理重復(fù)3次。由于超過12 h，其孢子萌發(fā)芽管交錯(cuò)復(fù)雜，很難統(tǒng)計(jì)，因此本試驗(yàn)在12 h內(nèi)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率(下同)。每4 h觀察1次，共觀察3次，每次記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.1.3 光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

方法如1.1.2，在20 ℃下分別設(shè)置全光照、2 h光暗交替和全黑暗3個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，每4 h觀察1次，共觀察3次，分別記錄孢子萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.1.4 不同環(huán)境物質(zhì)對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

方法如1.1.2，在20 ℃下設(shè)置無菌蒸餾水、1%葡萄糖液、0.5%葡萄糖液、0.1%葡萄糖液、10%苜蓿葉片榨汁液、20%苜蓿葉片榨汁液共6個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每4 h觀察1次，共觀察3次，記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算孢子萌發(fā)率，每重復(fù)調(diào)查孢子數(shù)不少于300個(gè)。

1.1.5 數(shù)據(jù)處理

利用公式(1)計(jì)算孢子萌發(fā)率，利用SPSS19.0、Excel等軟件進(jìn)行顯著性分析。

1.2 不同藥劑對苜蓿銹菌夏孢子室內(nèi)毒力測定

1.2.1 供試藥劑

供試藥劑及來源見表1。

1.2.2 藥劑處理及濃度的配制

首先將供試藥劑用二甲基亞砜溶解配制成20 000 mg/L的母液，再用丙酮溶解并稀釋成濃度為100、20、5、1、0.2 mg/L的溶液(制劑按有效成分計(jì)算)備用。

1.2.3 調(diào)查和數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，同時(shí)用無菌蒸餾水作空白對照。12 h后，當(dāng)空白對照孢子萌發(fā)率達(dá)到90%以上時(shí)，調(diào)查藥劑處理孢子萌發(fā)率，每重復(fù)隨機(jī)調(diào)查孢子總數(shù)不少于300個(gè)，分別記錄萌發(fā)數(shù)和孢子總數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率、校正萌發(fā)率、相對抑制萌發(fā)率，使用DPS 6.55軟件計(jì)算EC50、EC90，進(jìn)行毒力回歸分析等。

藥劑處理校正夏孢子萌發(fā)率(%)=

夏孢子萌發(fā)相對抑制率(%)=

表114種殺菌劑及來源

Table1Fourteenfungicidesandtheirsources

藥劑Fungicide來源Source95%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC上海禾本藥業(yè)有限公司97．7%咪鮮胺TC97．7%ProchlorazTC江蘇南通江山農(nóng)藥化工股份有限公司95%福美雙TC95%Arasan河北冠龍農(nóng)化有限公司96．2%烯酰嗎啉TC96．2%DimethomorphTC山東先達(dá)農(nóng)化股份有限公司95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC巴斯夫歐洲公司97%異菌脲TC97%IprodioneTC江蘇蘭豐生物化工有限公司96．2%嘧霉胺TC96．2%PyrimethanilTC浙江禾本科技有限公司95%百菌清TC95%ChlorothalonilTC山東大成農(nóng)化有限公司96%三唑酮TC96%TriadimefonTC江蘇省鹽城利民農(nóng)化有限公司97%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC上海生農(nóng)生化有限公司97%苯醚甲環(huán)唑TC97%DifenoconazoleTC上海生農(nóng)生化有限公司50%多菌靈WP50%CarbendazimWP江蘇江陰市福達(dá)農(nóng)化有限公司70%甲基硫菌靈WP70%Thiophanate?methylWP江蘇江陰市福達(dá)農(nóng)化有限公司80%代森錳鋅WP80%MancozebWP河北青園農(nóng)藥有限公司

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

由表2可知，夏孢子在5～30 ℃之間都可以萌發(fā)，但超過25 ℃時(shí)，隨著溫度的升高夏孢子的萌發(fā)率逐漸下降，當(dāng)達(dá)到35 ℃時(shí)，夏孢子失活，不萌發(fā)。從萌發(fā)時(shí)間看，在4 h時(shí)，夏孢子在5～25 ℃都能萌發(fā)并且隨著溫度的升高萌發(fā)率逐漸升高，20和25 ℃的萌發(fā)率極顯著高于其他溫度的萌發(fā)率；在8 h，20～25 ℃時(shí)，其萌發(fā)率顯著高于其他處理；在12 h，10～25 ℃的萌發(fā)率顯著高于30 ℃和5 ℃，達(dá)90%以上。

2.2 光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

不同光照處理對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響見表3，孢子萌發(fā)初期(4 h)，全光照和2 h光暗交替對夏孢子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，其萌發(fā)率顯著高于黑暗條件下，而隨著時(shí)間的延長，當(dāng)孢子萌發(fā)時(shí)間達(dá)到8 h或以上時(shí)，黑暗條件下的萌發(fā)率和光照條件下萌發(fā)率差異不顯著，均達(dá)90%以上。

表2不同溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)率的影響1)

Table2Effectsoftemperatureonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

溫度/℃Temperature萌發(fā)率/%Germinationrate4h8h12h531．99eD74．70cC88．02bB1044．35dC88．44bB93．81aA1570．56bB88．62bB93．20aA2085．58aA93．24aA94．80aA2589．79aA93．25aA95．33aA3054．58cC73．27cC81．43cC350fE0dD0dD

1) 表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫英文字母表示在0.05水平差異顯著；大寫英文字母表示在0.01水平差異顯著。下同。
Different lower-case letters in the same column indicate significant difference (P<0.05) and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below.

表3光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)率的影響

Table3Effectsoflightonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

光照條件Lightcondition萌發(fā)率/%Germinationrate4h8h12h暗Dark72．40bB92．24aA94．11aA光Light90．90aA95．02aA94．97aA2h光暗交替Alternationoflightanddarkfor2h86．79aA93．95aA95．32aA

2.3 環(huán)境物質(zhì)對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的影響

由表4可知，不同濃度的葡萄糖液和無菌蒸餾水處理的孢子萌發(fā)率相對較高，在12 h分別達(dá)96.02%、95.17%、94.11%和94.24%，而葉片榨汁液處理萌發(fā)率相對較低，10%和20%葉片榨汁液處理萌發(fā)率在12 h僅為84.80%和74.49%。從時(shí)間上看，各個(gè)處理的夏孢子基本在前8 h萌發(fā)，8 h后孢子萌發(fā)數(shù)較少，其中1%葡萄糖液在前4 h萌發(fā)最快，其萌發(fā)率已達(dá)93.38%，其次是0.5%葡萄糖液(91.03%),兩者均極顯著高于相同時(shí)間其他處理的萌發(fā)率，而在8、12 h時(shí)與低濃度的葡萄糖液處理以及蒸餾水處理差異不顯著。表明在孢子萌發(fā)初期，相對較高濃度的葡萄糖液有促進(jìn)孢子萌發(fā)的作用。

表4環(huán)境物質(zhì)對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)率的影響

Table4Effectsofnutritiononthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

處理Treatment萌發(fā)率/%Germinationrate4h8h12h無菌蒸餾水Steriledistilledwater84．27abB92．97bAB94．24aA1%葡萄糖1%Glucose93．38aA95．13aA96．02aA0．5%葡萄糖0．5%Glucose91．03aA93．61abAB95．17aA0．1%葡萄糖0．1%Glucose82．94bB91．64bB94．11aA10%榨汁液10%Laminasqueeze79．28cB84．15cC84．80bB20%榨汁液20%Laminasqueeze66．76dC71．81dD74．49cC

2.4 不同殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子室內(nèi)毒力測定

從不同藥劑的EC50(表5)可以看出，吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美雙、百菌清、代森錳鋅、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑?qū)俎ｄP菌夏孢子有不同程度的抑制作用，共有3種殺菌劑的EC50<1 mg/L，分別為吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美雙，其中吡唑醚菌酯的抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.040 1 mg/L。由毒力回歸方程的斜率反映藥劑的敏感度可知，在供試的殺菌劑中，嘧菌酯最為敏感。而咪鮮胺、異菌脲、嘧霉胺、三唑酮、烯酰嗎啉、多菌靈和甲基硫菌靈在設(shè)置的濃度范圍內(nèi)幾乎對夏孢子的萌發(fā)沒有抑制作用，表明這7種殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子不敏感。

表5不同殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子的室內(nèi)毒力測定

Table5Toxicitymeasurementofdifferentfungicidesonofalfalfarusturedospores

藥劑TestedpesticideEC50/mg·L-1EC90/mg·L-1相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient毒力回歸方程(y=)Regressionequation95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC0．04010．08860．93043．7217x+10．199395%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC0．06810．12810．96614．6667x+10．445895%福美雙TC95%ArasanTC0．19270．76880．90392．1324x+0．326295%百菌清TC95%ChlorothalonilTC1．75694．28820．95553．3070x+4．190680%代森錳鋅WP80%MancozebWP2．019050．48530．89870．9167x+4．720397%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC2．863935．58840．94381．1711x+4．464997%苯醚甲環(huán)唑TC97%DifenoconazoleTC7．780223．89860．83252．6295x+2．2658

3 結(jié)論與討論

通過對苜蓿銹菌夏孢子生物學(xué)特性的研究及室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明在100%的相對濕度下且在水膜中，苜蓿銹菌夏孢子在5～30 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，其最適萌發(fā)溫度為15～25 ℃，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時(shí)，夏孢子雖能萌發(fā)但產(chǎn)生高度扭曲的畸形芽管，溫度達(dá)到或超過35 ℃時(shí)，夏孢子基本上失活，不萌發(fā)，這和余仲東等人[10]研究溫度對松楊柵銹菌夏孢子萌發(fā)影響的結(jié)果具有相似性，松楊柵銹菌夏孢子在低于5 ℃和高于30 ℃時(shí)不萌發(fā)。不同環(huán)境物質(zhì)對夏孢子萌發(fā)的影響研究中可以發(fā)現(xiàn)，1%葡萄糖液有利于夏孢子萌發(fā)，在4 h萌發(fā)率達(dá)93.38%，顯著高于無菌蒸餾水處理的萌發(fā)率，而榨汁液萌發(fā)率顯著低于無菌蒸餾水處理的萌發(fā)率，反映了對夏孢子萌發(fā)產(chǎn)生了一定的抑制作用，造成這種原因可能與葉片浸出液中含有一些氧化物、酚類物質(zhì)有關(guān)[11]，郭志青等人[12]在研究落葉松楊柵銹菌夏孢子時(shí)也發(fā)現(xiàn)，適量的糖分能夠促進(jìn)夏孢子的萌發(fā)，但較高濃度的葉片浸出液反而影響孢子的萌發(fā)；在研究光照對夏孢子萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在孢子萌發(fā)初期，溫度在25 ℃時(shí)光照對孢子萌發(fā)沒有影響，而當(dāng)溫度在20 ℃時(shí)，光照、光暗交替、黑暗條件下在4 h的孢子萌發(fā)率分別為90.90%、86.79%、72.40%，可以看出光照對孢子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，這和梁巧蘭[13]等人研究康乃馨銹菌夏孢子生物學(xué)特性時(shí)得出的光照抑制孢子萌發(fā)的結(jié)論略有不同，這可能是由于不同種銹菌夏孢子生物學(xué)特性有所差異，然而隨著萌發(fā)時(shí)間的加長，在12 h各個(gè)光照條件處理的萌發(fā)率分別達(dá)到94.97%、95.32%和94.11%，差異不顯著，因而可以看出在相對較低溫度下，光照對夏孢子萌發(fā)初期產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。

有關(guān)銹菌毒力測定的研究，20世紀(jì)90年代周淑清等[14]在研究影響苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，多效唑和翠竹牌植物生長劑對孢子的萌發(fā)有顯著的抑制作用，但并沒有進(jìn)行多種殺菌劑的毒力測定。薛明珍等[15]通過小麥活體接種的方法研究小麥銹病防治時(shí)，發(fā)現(xiàn)丙環(huán)唑有較好的效果但其對孢子萌發(fā)是否有抑制作用未進(jìn)行研究說明。本試驗(yàn)進(jìn)行了14種殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子萌發(fā)的毒力測定，研究表明甲氧基丙烯酸類殺菌劑吡唑醚菌酯、嘧菌酯對銹菌夏孢子有較好的抑制作用，對銹菌夏孢子毒力測定EC50分別為0.040 1和0.068 1 mg/L，同時(shí)福美雙、百菌清和代森錳鋅在較低濃度也對夏孢子萌發(fā)有較好的抑制作用，因而在實(shí)際防治過程中這些藥劑可以輪換使用，以免單一藥劑的長時(shí)間使用產(chǎn)生抗藥性問題。但此次藥劑試驗(yàn)中，僅在室內(nèi)做了毒力測定，篩選出了幾種效果較好的抑孢殺菌劑，尚未得到室外或大田試驗(yàn)的驗(yàn)證，所以上述幾種殺菌劑對苜蓿銹菌的抑菌作用還有待于進(jìn)一步的明確，以便更科學(xué)地指導(dǎo)大田苜蓿銹病的有效防治。

綜上所述，在苜蓿銹病防治過程中，應(yīng)該充分考慮其生物學(xué)特性。由夏孢子生物學(xué)特性可知，在高溫情況下銹病不發(fā)生，一般發(fā)生在溫度較低和濕度較大的春季或秋季，因此，每年應(yīng)該在春季和秋季對各苜蓿種植區(qū)銹病的發(fā)生動(dòng)態(tài)提前做好監(jiān)控或預(yù)報(bào)，盡量在銹病潛育期或是發(fā)生前期進(jìn)行藥劑防治，以防大面積發(fā)生，造成不必要的損失。

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Biologicalcharacteristicsoftheuredosporesofalfalfarustandtoxicitytestofdifferentfungicidesinthelaboratory

Luo Fuchun1, Yuan Qinghua2， Wang Yu2， Shen Huimin1

(1.PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The biological characteristics of the uredospores of alfalfa rust were studied using the uredospores germination method. The results showed that the most suitable temperature for germination was 20-25 ℃ under 100% relative humidity；light and 1% glucose solution had promotion effect on spore germination. The toxicity test showed that pyraclostrobin and azoxystrobin had good effects on the uredospores of alfalfa rust, with an EC50value of 0.040 1 mg/L and 0.068 1 mg/L, respectively.

alfalfa rust; biological characteristics; fungicide; toxicity test

2013-11-06

：2013-12-12

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD17B01)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303057)

S 435.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.017

* 通信作者 E-mail: yuanqinghua@hotmail.com; ndshm@gsau.edu.cn