周 朋, 余乃通, 章紹延, 王健華,胡加誼, 王 祥, 梁 潔, 劉志昕

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, ?？?570228)

香蕉分化芽BBTVDAS-ELISA檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

周 朋1,2, 余乃通1*, 章紹延1, 王健華1,胡加誼1, 王 祥1, 梁 潔1, 劉志昕1*

(1. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口 571101；2. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, ?？?570228)

為了解海南?？谙憬斗只繑y帶香蕉束頂病毒(Bananabunchytopvirus, BBTV)的情況,本研究建立了雙抗夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)(DAS-ELISA)檢測(cè)法,對(duì)來自海南地區(qū)組培廠的香蕉分化芽進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明,6個(gè)品種1 852個(gè)香蕉分化芽平均帶毒率為2.1%,其中‘皇帝蕉’為1.98%,‘粵科1號(hào)’為2.07%,‘廣粉蕉’為1.98%,‘大蕉’為6.25%,‘218’為1.89%,‘巴西蕉’為2.25%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ELISA結(jié)果的可靠性,隨機(jī)選取12個(gè)陽(yáng)性樣品提取總DNA進(jìn)行PCR鑒定。鑒定結(jié)果顯示,12個(gè)樣品中11個(gè)檢測(cè)出有BBTV,表明DAS-ELISA方法的準(zhǔn)確率較高,與分子檢測(cè)結(jié)果基本一致,可以勝任日常香蕉組培苗BBTV的檢測(cè)。

香蕉束頂病毒； DAS-ELISA； 病毒檢測(cè)

香蕉(Musaspp.)屬于芭蕉科(Musaceae)芭蕉屬(MusaLinn.),是我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。香蕉種植業(yè)在中國(guó)海南是優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)之一,同時(shí)在該省種植香蕉具有區(qū)位、氣候和土地資源等客觀優(yōu)勢(shì)。但是,BBTV引起的香蕉束頂病威脅著世界1/4香蕉產(chǎn)區(qū)的生產(chǎn),且在我國(guó)海南地區(qū)病情較重,是海南香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素之一。受感染的香蕉會(huì)發(fā)育不良,逐漸萎縮,產(chǎn)生畸形果或無果,嚴(yán)重影響香蕉的產(chǎn)量[1-3]。近年來,無病毒組培苗的推廣使得香蕉上束頂病的發(fā)生大大減少,所以組培廠香蕉分化芽的病毒檢測(cè)在無毒苗生產(chǎn)中尤為重要。目前,國(guó)內(nèi)外BBTV的檢測(cè)方法主要有分子方法和血清學(xué)方法,Peng等[4]最近還報(bào)道了loop-mediated isothermal amplification(LAMP)檢測(cè)技術(shù),其中血清學(xué)方法操作簡(jiǎn)單,成本低,適合大量樣品的檢測(cè)[5]。

研究香蕉不同品種分化芽帶毒率差異與田間病毒病發(fā)生之間的關(guān)系,對(duì)香蕉田間生產(chǎn)具有非常重大的指導(dǎo)意義。胡漢橋[6]對(duì)廣東不同品種香蕉分化芽的香蕉線條病毒(Bananastreakvirus, BSV)和BBTV帶毒情況進(jìn)行了PCR檢測(cè),結(jié)果表明粉蕉上BSV發(fā)病最嚴(yán)重,其他品種發(fā)病率也在10%～52%；而PCR未檢測(cè)到BBTV感染。目前,海南地區(qū)尚未報(bào)道不同品種之間BBTV的帶毒情況。本研究利用DAS-ELISA法針對(duì)海南地區(qū)6個(gè)不同品種的香蕉分化芽進(jìn)行BBTV帶毒率檢測(cè),同時(shí)利用PCR技術(shù)對(duì)DAS-ELISA結(jié)果進(jìn)行抽檢,驗(yàn)證了結(jié)果的可靠性。本試驗(yàn)為進(jìn)一步監(jiān)控BBTV的流行情況和研究不同品種的抗病性提供了重要依據(jù),同時(shí)為海南省香蕉大規(guī)模種植生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測(cè)樣品

香蕉分化芽來自海南香蕉組培廠,陽(yáng)性對(duì)照是經(jīng)PCR檢測(cè)確定感染BBTV的香蕉葉片,陰性對(duì)照為健康香蕉苗。

1.1.2 試劑和引物序列

DAS-ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司(SRA 24700/0500)；植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司(目錄號(hào)：DP305)；EasyTaqDNA Polymerase購(gòu)自北京全式金技術(shù)有限公司；BBTV的引物序列根據(jù)GenBank中BBTV DNA1組分(HQ378190、HQ616074)的保守序列設(shè)計(jì)BBTV DNA1 F(5′ATGTGGTATGCTGGATGTTC3′)/BBTV DNA1 R(5′GTTCATATTTCCCGCTTTGA3′),退火溫度為55 ℃。

1.2 方法

1.2.1 DAS-ELISA法檢測(cè)BBTV

DAS-ELISA按照美國(guó)Agdia公司ELISA說明書操作,顯色后,用酶標(biāo)儀測(cè)定A405的吸光值。

1.2.2 DAS-ELISA法效價(jià)測(cè)試

將原核表達(dá)的BBTV CP融合蛋白作為免疫原,以1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000、1∶1 024 000、1∶2 048 000倍稀釋為12個(gè)梯度,初始濃度為2 μg/mL。按照美國(guó)Agdia公司ELISA說明書操作,顯色后,用酶標(biāo)儀測(cè)定A405的吸光值。

1.2.3 香蕉分化芽總DNA提取

取香蕉分化芽,用液氮研磨后稱取100 mg樣品,按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取病樣總DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應(yīng)體系及程序

BBTV檢測(cè)的PCR擴(kuò)增體系按照北京全式金技術(shù)有限公司EasyTaqDNA Polymerase說明書設(shè)計(jì),反應(yīng)體系為提取的總DNA模板0.02 mg,10×Buffer(含Mg2+)2 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,EasyTaqDNA Polymerase(5 U/mL) 0.2 μL,10 μmol/L的上下游引物各0.5 μL,用滅菌的ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min,16 ℃保存。反應(yīng)后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗血清效價(jià)測(cè)試

試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)抗體稀釋到1∶64 000倍時(shí)與空白對(duì)照數(shù)值一致。而1∶1 000稀釋的抗體檢測(cè)結(jié)果是1∶64 000稀釋倍數(shù)(或水對(duì)照)檢測(cè)數(shù)值的2.5倍(圖1),分析表明Agdia公司制備的抗血清能用于檢測(cè)香蕉分化芽。但是由于苗芽的生長(zhǎng)時(shí)間較短,病毒積累量較低等原因,判定陽(yáng)性和陰性的比值有所調(diào)整,以A405(樣品)為A405(健康對(duì)照)的1.5倍及以上即判定為陽(yáng)性,并用PCR等分子檢測(cè)方法驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 抗血清效價(jià)測(cè)定

2.2 不同香蕉樣品的DAS-ELISA檢測(cè)

經(jīng)DAS-ELISA法對(duì)1 852個(gè)樣品的檢測(cè),結(jié)果表明,‘大蕉’、‘皇帝蕉’、‘粵科1號(hào)’、‘廣粉蕉’、‘218’和‘巴西蕉’共檢出陽(yáng)性樣品39個(gè)(表1),BBTV的平均檢出率為2.1%,其中‘大蕉’檢出率最高,為6.25%；354個(gè)‘皇帝蕉’檢出率為1.98%；531個(gè)‘粵科1號(hào)’檢出率為2.07%；252個(gè)‘廣粉蕉’檢出率為1.98%；211個(gè)‘218’檢出率為1.89%,488個(gè)‘巴西蕉’檢出率為2.25%(表2)。

2.3 PCR驗(yàn)證

從DAS-ELISA法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品中隨機(jī)挑取12個(gè),試劑盒提取其總DNA,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果條帶清晰,質(zhì)量較好。PCR法結(jié)果顯示12個(gè)樣品中的11個(gè)均擴(kuò)增到一條大小約為1 100 bp的帶(圖2)。該結(jié)果證明DAS-ELISA法檢測(cè)香蕉分化芽中BBTV的準(zhǔn)確率較高,與PCR分子檢測(cè)的結(jié)果基本一致,可以勝任日常香蕉分化芽中BBTV的大規(guī)模檢測(cè)。

表11852個(gè)香蕉分化芽中檢測(cè)到的39個(gè)陽(yáng)性樣品

Table1Thirty-ninepositivesamplesdetectedfrom1852bananadifferentiatedshootswerebyDNA-ELISA

編號(hào)SamplenameA405樣品Sample陽(yáng)性對(duì)照CK+陰性對(duì)照CK-編號(hào)SamplenameA405樣品Sample陽(yáng)性對(duì)照CK+陰性對(duì)照CK-編號(hào)SamplenameA405樣品Sample陽(yáng)性對(duì)照CK+陰性對(duì)照CK-S60．2020．1950．106K40．4300．5320．170P180．1520．1510．077S700．2060．1950．106K140．4080．5320．170P210．1230．1510．077S710．2070．1950．106L370．3310．4550．129P380．1220．1510．077T450．1510．1600．720L490．3220．4550．129N430．1200．1510．077T990．1930．1600．067H900．1590．1320．072R10．1520．1610．068V280．1850．1400．062M680．3960．6320．138R120．190．1610．068V560．1760．1400．062D110．5241．0450．263R220．1630．1610．068V740．1810．1400．062F680．1200．1390．075U200．1580．1610．068U900．2210．1400．062G361．1520．1270．061N160．1630．1520．078V790．1020．1090．059G490．1230．1270．061N540．1660．1520．078W860．3080．1800．116F580．1450．1270．061N640．1730．1520．078I60．2650．1800．116D40．1430．1320．070N670．1820．1520．078J210．4010．5320．017P170．1520．1510．077H50．2080．1320．072

表2不同品種香蕉分化芽帶BBTV情況

Table2BBTV-carryingrateamongthe6bananavarieties

樣品材料Material基因型Genotype檢測(cè)總數(shù)/個(gè)Totalnumber陽(yáng)性株數(shù)/個(gè)Positivenumber檢出率/%Positiverate皇帝蕉HuangdibananaAA35471．98廣粉蕉GuangfenbananaABB25251．98大蕉MusasapientumABB1616．25粵科1號(hào)YuekeNo．1AAA531112．07218AAA21141．89巴西蕉BrazilbananaAAA488112．25

圖2 PCR鑒定12個(gè)ELISA陽(yáng)性樣品

3 結(jié)論與討論

BBTV株系繁多[7],且不同株系對(duì)寄主的感染情況也不同,何自福等[8]分離的BBTV高州分離物不能侵染粉蕉,而天河分離物卻可以侵染粉蕉。DAS-ELISA結(jié)果表明海南‘大蕉’的BBTV檢出率最高,達(dá)到6.25%,其他香蕉品種的檢出率均在2%左右,表明海南BBTV株系更易侵染‘大蕉’,該推斷有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本試驗(yàn)以A405(樣品)/A405(健康對(duì)照)大于等于1.5倍判定為陽(yáng)性，主要基于以下3點(diǎn)原因：1)用于本試驗(yàn)的ELISA的多克隆抗血清是直接利用提純的BBTV病毒粒子免疫家兔產(chǎn)生的,它對(duì)各BBTV株系靈敏程度也不一樣,會(huì)對(duì)檢測(cè)造成一定的誤差[9]；2)本次檢測(cè)是由不同人分批次完成的,所用陽(yáng)性樣品也不同,顯色時(shí)間控制不夠嚴(yán)格；3)香蕉體內(nèi)BBTV病毒含量極低。這些因素使得本次檢測(cè)的結(jié)果不夠穩(wěn)定。故本試驗(yàn)對(duì)DAS-ELISA方法判定陽(yáng)性和陰性的A405比值有所調(diào)整。

BBTV的寄主范圍較窄,主要通過香蕉交脈蚜(Pentalonianigronervosa)以持久方式傳播,周仲駒等[10]接種測(cè)定結(jié)果表明,‘香蕉’、‘粉芭蕉’和‘大蕉’等是香蕉束頂病毒的主要寄主。所以種植無病蕉苗、及時(shí)鏟除病株和防治香蕉交脈蚜是減少香蕉束頂病(Banana bunchy top disease, BBTD)病害發(fā)生的3個(gè)主要手段。本研究香蕉幼苗DAS-ELISA檢測(cè)方法的建立,對(duì)香蕉田間生產(chǎn)具有非常重大的指導(dǎo)意義。

另外,黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)和香蕉線條病毒(Bananastreakvirus, BSV)也是引起我國(guó)香蕉病毒病的重要病毒,在檢測(cè)分化芽BBTV時(shí)還要同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒,才能做到真正的無毒苗,將香蕉病毒病造成的損失降到最小[11]。

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EstablishmentandapplicationofDAS-ELISAmethodfordetectionof
Bananabunchytopvirusinbananadifferentiatedshoots

Zhou Peng1,2, Yu Naitong1, Zhang Shaoyan1, Wang Jianhua1,Hu Jiayi1, Wang Xiang1, Liang Jie1, Liu Zhixin1

(1.KeyLaboratoryofBiologyandGeneticResourcesofTropicalCrops,MinistryofAgriculture,InstituteofTropical
BioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou571101,China;2.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou570228,China)

In order to understand the situation ofBananabunchytopvirus(BBTV) infection in banana differentiated shoots in Hainan, 1 852 shoot samples from 6 banana varieties were detected by DAS-ELISA method. The results showed that the average BBTV-carrying rate was 2.1%, while 1.98% of ‘Huangdi’ banana, 2.07% of ‘Yueke No.1’ banana, 1.98% of ‘Guangfen’ banana, 6.25% ofMusasapientum, 1.89% of ‘218’ banana, and 2.25% of ‘Brazil’ banana, respectively. To further confirm the accuracy of DAS-ELISA result, 12 BBTV-carrying samples were selected for molecular detection by PCR. The results showed that 11 of them were BBTV positive, indicating DAS-ELISA method with the high accuracy can be used for BBTV detection in banana differentiated shoots.

Bananabunchytopvirus； DAS-ELISA； virus detection

2013-10-09

：2014-04-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31070131)；海南省重大科技項(xiàng)目子課題(ZDZX2013023-1)；2012年度海南省研究生創(chuàng)新科研課題(Hys2012-15)

S 432.41

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.021

* 通信作者 E-mail:yunaitong@163.com； liuzhixin@itbb.org.cn