廖 庭，秦 健，袁高慶，黎起秦，林 緯，彭好文

(廣西大學農(nóng)學院,南寧 530005)

研究報告

巨大芽胞桿菌B196菌株抑菌物質(zhì)的分離純化

廖 庭，秦 健，袁高慶，黎起秦*，林 緯，彭好文

(廣西大學農(nóng)學院,南寧 530005)

巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)B196菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)的生長具有較強的抑制作用，明確該菌產(chǎn)生拮抗物質(zhì)的種類是進一步研究該菌的抑菌機制及其應(yīng)用的基礎(chǔ)。本文采用鹽酸沉淀B196菌株的去菌體培養(yǎng)液，再用甲醇抽提獲得拮抗物質(zhì)的粗提物。利用反相HPLC系統(tǒng)，將粗提物過C18柱，收集有抑制水稻紋枯病菌生長作用的活性化合物。運用質(zhì)譜測得其分子量分別為1042.592 7 u，再利用碰撞誘導解離(CID)技術(shù)獲得化合物的典型結(jié)構(gòu)特征離子碎片，結(jié)果表明其一級結(jié)構(gòu)為Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln (βAA為14個碳原子的氨基脂肪酸)。綜合以上信息將該化合物鑒定為Iturin A2。

巨大芽胞桿菌； iturin A2； 分離純化

巨大芽胞桿菌(Bacillusmegateriumde Bary)是一類好氧、革蘭氏陽性、可生長在土壤和植物體內(nèi)的芽胞桿菌細菌，它可以被用來吸附金屬Au3+[1]、凈化水體[2]、降解農(nóng)藥[3]、解磷解鉀[4]等，被廣泛地應(yīng)用在環(huán)境保護方面。此外，巨大芽胞桿菌還可以產(chǎn)生抑制植物病原菌的抗菌物質(zhì)[5]，因而在植物病害防治方面也受到人們的關(guān)注。目前已有報道分離出一些對植物病原菌有較強拮抗作用的菌株[6]，一些菌株對一些植物病害有較好的防治作用[7]，巨大芽胞桿菌可產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有蛋白類[5]、揮發(fā)性物質(zhì)[8]、細菌素[9]和脂肽類物質(zhì)等[10]。

巨大芽胞桿菌B196菌株是廣西大學農(nóng)學院植物病理研究室從水稻上分離出來的拮抗細菌，在離體、盆栽和大田試驗中，該菌株對水稻紋枯病均表現(xiàn)出較好的防效[11]。前期工作發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵濾液對玉米小斑病菌[Bipolarismaydis(Nisik & Miyake)Shoem.] 和水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)具有較強的抑菌活性[12]。為了明確該菌株的發(fā)酵濾液所含的拮抗物質(zhì)種類，本研究采用鹽酸沉淀、甲醇提取和高效液相色譜分離等方法對抑菌物質(zhì)進行分離純化和鑒定，為進一步研究該菌的抑菌機制和開發(fā)防治水稻紋枯病的新型藥劑打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

拮抗菌：巨大芽胞桿菌(B.megaterium)B196菌株；植物病原菌：稻瘟病菌[Magnaporthegrisea(Hebert) Barr.]、煙草赤星病菌[Alternariaalternata(Fries) Keissler ]、煙草灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)、水稻紋枯病菌(R.solani)、玉米白絹病菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)、西瓜枯萎病菌[Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith) SnyderetHansen]和黃瓜綿腐病菌[Pythiumaphanidermatum(Edson) Fitzpatrick]，以上病原菌均來源于廣西大學農(nóng)學院植病研究室。

1.1.2 色譜分離材料

分析柱C18(Jupiter，5 μm，250mm×4.6mm)、制備柱C18(PRC-ODS，20mm×250mm)、離心濃縮機(Labconco CentriVap)、高效液相色譜儀(Shimadzu LC-6AD)為島津公司生產(chǎn)，乙腈、乙酸銨均為色譜級。

1.2 拮抗物質(zhì)的分離純化

1.2.1 B196菌株的培養(yǎng)及其抑菌物質(zhì)的提取

以水稻紋枯病菌為靶標，采用活性跟蹤分離純化B196菌株產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)[13]。將保存在4 ℃的B196菌株接種于NA培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)48 h后取一環(huán)B196菌株接種至種子培養(yǎng)基(葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、蒸餾水1000mL、pH7.0)中，30℃、130r/min下培養(yǎng)12 h后再轉(zhuǎn)移至發(fā)酵培養(yǎng)基(蔗糖10g、大豆蛋白胨20g、NaCl 7 g、K2HPO45 g、蒸餾水1000mL、pH 7.0)，27 ℃，130r/min，振蕩培養(yǎng)5 d。之后將B196菌株的發(fā)酵液6000r/min離心20min，去除菌體，收集上清液，用6mol/L的HCl將上清液的pH調(diào)為2.0，4 ℃下靜置24 h后，于8 000r/min離心25 min，去除上清液，收集沉淀。合并所有的鹽酸沉淀，加入適量的甲醇，將pH調(diào)為7.0，靜置2 h，抽提甲醇，于60℃下進行減壓濃縮，獲得深黃色的粗提物，備用。

1.2.2 抗菌物質(zhì)的抑菌活性測定方法

采用菌絲生長速率法：將分離純化獲得的各餾分于1/15 mol/L磷酸緩沖液(pH6.81)中溶解，取0.1mL各餾分與5 mL的PSA培養(yǎng)基(45 ℃左右)混勻，倒入6cm的培養(yǎng)皿中，冷卻后備用。用直徑為7 mm的打孔器在水稻紋枯病菌菌落邊緣切取菌餅，將病菌反向接入培養(yǎng)皿中央，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h后測量菌落直徑，并計算抑菌率，以磷酸緩沖液和清水處理為對照，每處理3次重復。

1.2.3 HPLC分析

用流動相溶解粗提物，采用等度洗脫，液相色譜條件：色譜柱C18(Jupiter， 5 μm，250mm×4.6mm)，流動相含乙腈10mmol/L，V(乙酸銨)∶V(水溶液)=40∶60，波長為214 nm，流速為0.8 mL/min，室溫，樣品濃度為10mg/mL，進樣量為10μL。收集各色譜峰樣品，用離心濃縮機濃縮和干燥，以水稻紋枯病菌為靶標菌，采用菌絲生長速率法檢測各色譜峰樣品的抑菌活性。

1.2.4 HPLC分離純化

分離純化條件：流動相含乙腈10mmol，V(乙酸銨)∶V(水溶液)=40∶60，波長214 nm，流速為8 mL/min，制備柱C18(PRC-ODS，20mm×250mm)，樣品用流動相液溶解，濃度為20mg/mL，進樣量1mL，集中收集活性峰，用離心機濃縮和冷凍干燥后獲得活性物質(zhì)。

1.3 活性組分的鑒定

樣品送至廣西大學生命科學與技術(shù)學院，采用反射模式采集每個樣品的一級質(zhì)譜信息(MS)，激光強度4 000，質(zhì)量范圍800～4 000u，一級質(zhì)譜掃描完成后，選取7個信號強度最高的母離子進行二級質(zhì)譜分析(MS/MS)，加速電壓2 kV，采用CID碰撞裂解母離子，獲取每個母離子的離子碎片指紋譜。

1.4 純化合物對植物病原菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法測定化合物對植物病原真菌的毒力：用1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)溶解純品后分別配制成5種濃度，取0.1mL純品溶液與5 mL的PSA培養(yǎng)基混勻，倒入6cm的培養(yǎng)皿中，冷卻后接入植物病原菌，以磷酸緩沖液和清水為對照，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)。待對照菌落基本長滿培養(yǎng)皿后測量菌落直徑，并計算抑菌率，每處理3次重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分析

粗提物經(jīng)分析柱C18(Jupiter，5 μm，250mm×4.6mm)分離的色譜圖見圖1。在8.4 min時出現(xiàn)一個呈正態(tài)分布的峰形，從該峰收集的樣品對水稻紋枯病菌有抑菌活性。

2.2 HPLC分離純化

樣本經(jīng)HPLC分離純化后，分別在3.9～6.2 min和16.4～17.2 min集中出現(xiàn)洗脫峰(圖2)，抑菌活性檢測結(jié)果表明，在16.4～17.2 min出現(xiàn)的洗脫峰物質(zhì)，在濃度為100μg/mL時，對水稻紋枯病菌的抑菌率為81.03%，分離純化的物質(zhì)經(jīng)離心機濃縮和冷凍干燥后得到的白色粉末即為純品，且純拮抗物質(zhì)的提取率為5%。

圖1 B196菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)在分析柱中的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the active substances produced by Bacillus megatherium strain B196

圖2 B196菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在HPLC上的分離純化Fig.2 Purification of the active substance produced by the strain B196on HPLC

2.3 活性物質(zhì)的純度

已分離純化的物質(zhì)在分析色譜柱C18(Jupiter，5 μm，250mm×4.6mm)，流動相含乙腈10mmol/L，V(乙酸銨)∶V(水溶液)=40∶60，波長為214 nm，流速為0.8 mL/min 時檢測其純度，結(jié)果見圖3。在8.4 min時出現(xiàn)一個呈正態(tài)分布的峰形，從該峰收集的樣品對水稻紋枯病菌有抑菌活性。該洗脫峰與2.1HPLC分析中在8.4 min時出現(xiàn)的呈正態(tài)分布峰形一致。根據(jù)面積歸一法獲知其面積大于94%，說明分離獲得的拮抗物質(zhì)純度已達94%以上，可以進行質(zhì)譜鑒定。

圖3 分離純化的拮抗物質(zhì)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the active substance purified from the strain B196

2.4 活性組分的鑒定

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對化合物進行一級質(zhì)譜分析(圖4)，獲知該化合物的質(zhì)荷比(m/z)為1043.592 7、1065.579 1和1081.554 1，它們分別是化合物的質(zhì)子化(M+H+)峰、鈉離子(M+Na+)和鉀離子(M+K+)加合峰，結(jié)果表明該化合物的分子量為1042.592 7 u。將此質(zhì)譜圖結(jié)果與前人研究結(jié)果[14-16]進行比對時，可以初步估計分子量為1042.592 7 u的化合物是伊枯草菌素A2。

圖4 純品的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF-MS spectrum of the purified substance

圖5 純品的MALDI-TOF-MS/MS CID色譜圖Fig.5 MALDI-TOF-MS/MS CID spectrum of the purified substance

多肽類物質(zhì)被電離后，會形成多種強度不同的離子，據(jù)Roepstorff P等[17]和Biemann K等[18]的報道：當電荷保留在N-端時，會從多肽類物質(zhì)N-端3個裂解點開始分別形成an、bn、cn系列離子，且bn系列離子的質(zhì)量數(shù)，是斷裂后的基團的質(zhì)量數(shù)；當電荷保留在N-端時，會從多肽類物質(zhì)N-端3個裂解點開始依次形成zn、yn和xn系列離子，且yn系列離子的質(zhì)量數(shù)，是斷裂后的基團的質(zhì)量數(shù)加上2H。其中bn系列和yn系列離子是確定氨基酸序列的關(guān)鍵離子，其他離子屬于離子片段。

純品的二級質(zhì)譜(圖5)，參照Yu G Y等[16]描繪的模式，先將伊枯草菌素A2的一級結(jié)構(gòu)排列出來，然后分成a型離子、b型離子、c型離子、x型離子、y型離子和z型離子(圖6)。從圖5中可以獲得的a型離子、b型離子、c型離子、x型離子、y型離子和z型離子數(shù)據(jù)(表1)。因為b類型是從左至右將結(jié)構(gòu)殘基切斷，而y類型則是由右到左將結(jié)構(gòu)殘基切斷，所以通過圖5中b、y型離子之間的差值與氨基酸殘基分子量的比較，可以獲得片段結(jié)構(gòu)分別為Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln、Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr。而Ser-βAA-Asn-Tyr為這兩個結(jié)構(gòu)片段的共同部分，所以結(jié)合這兩個片段結(jié)構(gòu)推斷出純品的一級結(jié)構(gòu)為Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln。因為βAA的質(zhì)荷比m/z=b4-b3=y5-y4=225，故可以推斷此氨基脂肪酸鏈應(yīng)該含有14個碳原子，且其質(zhì)子化結(jié)構(gòu)為-H2N+=CH-C12H25-CO-。

綜合純品的分子量和MALDI-TOF-MS/MS CID色譜圖等信息，確認其為伊枯草菌素家族的iturin A2。

圖6 Iturin A2質(zhì)子化(M+H+)的誘導碰撞解離碎片[16]Fig.6 Possible fragments of iturin A2(M+H)+by CID

表1 純品的MS/MS數(shù)據(jù)Table 1 Mass spectrometry/mass spectrometry (MS/MS) data of the purified substance

2.5 純化合物對植物病原菌的毒力

采用菌絲生長速率法測定純化合物對7種植物病原菌的毒力結(jié)果見表2。結(jié)果表明：純化合物對植物病原菌普遍具有較高的抑菌作用。其中，純品對稻瘟病菌的毒力最強，EC50達到了11.9700μg/mL；其次為煙草赤星病菌、煙草灰霉病菌、水稻紋枯病菌、玉米白絹病菌和西瓜枯萎病菌；對黃瓜綿腐病菌的毒力最弱，EC50為102.059 2 μg/mL。

表2純化物質(zhì)對植物病原菌的毒力1)

Table2Toxicityofthepurifiedsubstanceagainstplantpathogenicfungi

植物病原菌Plantpathogenicfungi毒力回歸方程(Y=)Regressionequationoftoxicity抑菌中濃度(EC50)/μg·mL-1Medianeffectiveconcentration95%置信區(qū)間/μg·mL-195%Confidenceinterval相關(guān)系數(shù)Correlationcoefficient稻瘟病菌Magnaporthegrisea2．6980X+2．091411．9700 8．3459～17．1678 0．9533煙草赤星病菌Alternariaalternata1．3295X+1．329512．38169．2100～16．6455 0．9674煙草灰霉病菌Botrytiscinerea1．5111X+2．970222．048015．8952～30．5826 0．9626水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani2．8910X+0．382339．562132．6826～47．8897 0．9863玉米白絹病菌Sclerotiumrolfsii1．9371X+1．872041．186928．7190～59．0674 0．9554西瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum1．9605X+1．537558．359242．6268～79．9166 0．9736黃瓜綿腐病菌Pythiumaphanidermatum1．9711X+1．0404102．059269．0827～150．7769 0．9767

1) 數(shù)據(jù)為3次重復的平均值；EC50為根據(jù)毒力方程的計算值。 The data were the mean of 3replicates.EC50was the value calculating from the virulence equation.

3 結(jié)論與討論

對于脂肽化合物的分離純化，一般都要經(jīng)過鹽酸沉淀、甲醇提取、硅膠柱層析、凝膠柱層析和高效液相色譜等方法才能獲得純品[13,16,19]，而本研究直接采用高效液相色譜對拮抗菌代謝產(chǎn)物的甲醇提取物進行分離純化，并獲得純度較高的iturin A2，簡化了步驟。陳華等[20]也是通過高效液相色譜獲得了iturin A2，但是他們采用梯度洗脫，流動相采用0.1%三氟乙酸的乙腈：0.1%三氟乙酸的超純水，25 min內(nèi)由30∶70逐漸過渡為55∶45，且在18.5 min左右才能開始收集iturin A2。而本研究是通過等度洗脫，在圖1中，iturin A2在8.4 min即可收集，說明此條件可以更加快速、高效地獲得純品。

飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是近年發(fā)展較快的一門技術(shù)，它在生命科學研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在蛋白質(zhì)的鑒定方面，不少研究者[20-22]通過飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對肽類物質(zhì)進行鑒定，并獲知了該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。本研究亦利用此技術(shù)將巨大芽胞桿菌B196菌株分泌的拮抗物質(zhì)進行鑒定，并確定其一級結(jié)構(gòu)為Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln。

Iturin A2能夠抑制立枯絲核菌(R.solani)[16]、玉米小斑病菌(B.maydis)[13]和小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)[19]等植物病原真菌的生長，也能夠抑制水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)和黃瓜細菌性角斑病菌(Pseudomonassyringaepv.lachrymans)[25]等植物病原細菌的生長。同時，iturin A2在田間可有效地防治玉米小斑病[13]。在本研究中，iturin A2雖然對卵菌的抑制作用相對較差，但是對植物病原菌普遍都具有較高活性，這一點跟陳華等[19]的研究結(jié)果相似?？梢?，巨大芽胞桿菌(B.megaterium)B196菌株分泌的iturin A2對植物病害具有較好的生防潛力，具有開發(fā)成防治植物病害生物型農(nóng)藥的前景。

據(jù)報道，巨大芽胞桿菌作為生防菌，可防治南方根結(jié)線蟲[Meloidogyneincognita(Kofoid and White) Chitwood][26]、小麥全蝕病[Gaeumannomycesgraminisvar．tritici(Sacc.) Walker]、小麥紋枯病(Rhizoctoniacerealisvan der Hoeven)、棉花立枯病(RhizoctoniasolaniKühn)和棉花枯萎病[Fusariumoxysporumf．sp．vasinfectum(Atk.)Snyder et Hansen][27]等植物病害，但普遍存在著對植物病害防治效果低、防效單一、防效易受菌體在土壤中定殖能力的影響等缺點[27]。本研究已確定巨大芽胞桿菌(B.megaterium)B196菌株分泌出的抗菌物質(zhì)是iturin A2，但在田間對植物病害的防效如何，有待試驗證實。

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IsolationandpurificationofanantimicrobialsubstanceproducedbyBacillusmegateriumstrainB196

Liao Ting, Qin Jian, Yuan Gaoqing, Li Qiqin, Lin Wei, Peng Haowen

(CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning530005,China)

An antimicrobial substance produced byBacillusmegateriumstrain B196can strongly inhibit the growth ofRhizoctoniasolani．Identification of the antimicrobial substance is very important for further research on the inhibition mechanism and its application．Crude antimicrobial substances were extracted with methanol from the precipitate which was obtained by adding HCl to the cell-free culture broth and then stored at 4 ℃ overnight．The crude extract was further purified by reversed-phase HPLC with a C18 column(PRC-ODS，20×250nm)to separate the substances．An antifungal compound with strong inhibitory activity againstR.solaniwas purified．The molecular weight of the compound was 1042.592 7 u by Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer(MALDI-TOF-MS)．TESI collision induced dissociation mass spectrometry analysis demonstrated that the compound had a primary structure of Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln.Therefore,the compound was identified as Iturin A2.

Bacillusmegaterium； iturin A2； isolation and purification

2013-05-31

：2013-09-27

廣西自然科學基金項目(2011GXNSFA018064)

S482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.004

* 通信作者 E-mail： qqli5806@gxu.edu.cn