張子萍，葛正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

白內(nèi)障是目前世界上主要的致盲性眼病。在老年人中的發(fā)病率較高,其主要表現(xiàn)為晶狀體的混濁。到目前為止，還無(wú)延緩白內(nèi)障發(fā)生的有效方法，只有成熟時(shí)采取手術(shù)治療[1]。探索有效的方法抑制白內(nèi)障發(fā)生非常有必要。

αA-晶體蛋白是晶體上皮細(xì)胞的特異表達(dá)蛋白，有分子伴侶活性，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，保護(hù)它們免受進(jìn)一步的變性和降解，并能使聚集的蛋白質(zhì)解聚,從而保證晶狀體正常的透光度。晶狀體中α-晶體蛋白量隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)逐漸減少，使相應(yīng)的分子伴侶功能下降，導(dǎo)致白內(nèi)障形成。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是目前公認(rèn)的蛋白保護(hù)因子，有分子伴侶功能。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是其重要成員之一，對(duì)保護(hù)晶狀體的透明性有著重要的作用[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究αA晶體蛋白組織特異性啟動(dòng)子(αACP)驅(qū)動(dòng)的HSP70基因?qū)Υ笫蟀肴樘切园變?nèi)障形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70 (本室已構(gòu)建)；多價(jià)陽(yáng)離子脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000，美國(guó)Invotrogen公司)；D-半乳糖(張家港市思普生化有限公司)配成50%注射液,常規(guī)滅菌后使用；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥株式會(huì)社),供鏡檢前擴(kuò)瞳用。

1.2 主要儀器 裂隙燈顯微鏡(蘇州醫(yī)療器械廠)，熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3周齡SD大鼠160只，平均體重(50±5) g，健康，無(wú)眼疾，雌雄不拘(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥方法[3]將160只SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組32只。分別為：①NS組(陰性對(duì)照)；②半乳糖+ Lipo-pαACP-HSP70組(簡(jiǎn)寫(xiě)為半乳糖+α-70組)；③半乳糖+Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70組(簡(jiǎn)寫(xiě)為半乳糖+ HSP70組)；④半乳糖+ Lipo-pIRES2-EGFP組(簡(jiǎn)寫(xiě)為半乳糖+EGFP組)；⑤半乳糖+NS組(陽(yáng)性對(duì)照)。第1步：②③④⑤組頸背部皮下注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的D-半乳糖(30mL·kg-1·d-1)，連續(xù)30d。第2步：注射半乳糖4h后，分別為①②③④⑤組單側(cè)眼球球后注射0.9%NS、Lipo-pαACP-HSP70混合液、Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70混合液、Lipo-pIRES2-EGFP混合液、0.9%NS 0.1 m L/只，隔日1次，連續(xù)15次。各種藥液注射后均需留針30s以防藥液從針眼處滲漏(注：第1步與第2步同時(shí)進(jìn)行)。

在第1次給藥后7、14、21和30 d隨機(jī)處死8只大鼠，摘除眼球，分離出晶狀體。

1.4.2 LipofectamineTM2000/質(zhì)粒復(fù)合液制備 按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)，將脂質(zhì)體與質(zhì)粒(pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-HSP70、pαACP-HSP70)分別用0.9%NS稀釋，脂質(zhì)體與質(zhì)粒比例為3μL:1μg，混勻靜置，制備濃度為3μg/μL的脂質(zhì)體/質(zhì)粒復(fù)合物(Lipo-pIRES2-EGFP、Lipo-pIRES2-EGFP-HSP70、Lipo-pαACP-HSP70)。

1.4.3 晶狀體混濁度觀察 從第1次給藥后第3d開(kāi)始，每日在裂隙燈顯微鏡下觀察各組大鼠的晶狀體混濁情況。參照Kador等[4]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將晶狀體混濁度分為5級(jí)，I級(jí)：晶狀體透明，無(wú)混濁；II級(jí)：晶狀體輕度渾濁,周邊出現(xiàn)空泡或線狀改變；Ⅲ級(jí)：晶狀體周邊空泡向中心擴(kuò)展，出現(xiàn)霧狀混濁為中度混濁；1V級(jí)：晶狀體高度渾濁,空泡擴(kuò)展到核區(qū),中心核霧狀渾濁加重；V級(jí)：核混濁，白內(nèi)障成熟。記錄結(jié)果并照相。

1.4.4 熒光顯微鏡下觀察 制作冰凍切片，通過(guò)觀察熒光強(qiáng)度了解pαACP-HSP70中EGFP基因在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)情況,以平均熒光強(qiáng)度代表蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 晶狀體混濁度檢查(見(jiàn)表1～4) ①NS組：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程未出現(xiàn)晶狀體混濁(見(jiàn)表1,圖1)；②半乳糖+NS組：第7天見(jiàn)94%晶狀體出現(xiàn)空泡Ⅱ級(jí)及以上改變(見(jiàn)表1)；第14天時(shí)88%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級(jí)及以上改變(見(jiàn)表2)；第21天時(shí)94%大鼠晶狀體出現(xiàn)Ⅳ級(jí)及以上改變(見(jiàn)表3)；第30天時(shí)100%大鼠晶狀體出現(xiàn)V級(jí)改變(見(jiàn)表4, 圖1B,圖2)；③半乳糖+EGFP組白內(nèi)障出現(xiàn)的時(shí)間、程度與同期的半乳糖組+NS相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1～4,圖1)；④半乳糖+HSP70組：在第7天時(shí)84%晶狀體出現(xiàn)Ⅱ級(jí)及以上改變(見(jiàn)表1)；第14天時(shí)79%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上改變(見(jiàn)表2)；第21天時(shí)38%晶狀體出現(xiàn)IV級(jí)及以上變化(見(jiàn)表3)，第30天時(shí)25%晶狀體出現(xiàn)V級(jí)改變(見(jiàn)表4)，⑤半乳糖+α-70組在第7天時(shí)只有59%晶狀體出現(xiàn)Ⅱ級(jí)及以上改變(見(jiàn)表1)；第14天時(shí)46%晶狀體出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上改變(見(jiàn)表2)；第21天時(shí)19%晶狀體出現(xiàn)IV級(jí)及以上改變(見(jiàn)表3)，第30天時(shí)只有約13%晶狀體出現(xiàn)V級(jí)改變 (見(jiàn)表4)，該組白內(nèi)障出現(xiàn)的程度與同期的半乳糖+NS組、半乳糖+EGFP組及半乳糖+HSP70組相比明顯減輕(P<0.05)，并且其所出現(xiàn)白內(nèi)障的時(shí)間亦延遲。

表1實(shí)驗(yàn)第7天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組BC320000半乳糖+α-70組AC1319000半乳糖+HSP70組AB527000半乳糖+EGFP組ABD427100半乳糖+NS組ABD228200

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，DP>0.05。

表2實(shí)驗(yàn)第14天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組 BC240000半乳糖+α-70組 AC0131010半乳糖+HSP70組AB051810半乳糖+EGFP組ABD022020半乳糖+NS組ABD031920

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，DP>0.05。

表3實(shí)驗(yàn)第21天裂隙燈下各組大鼠晶狀體混濁度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組BCE160000半乳糖+α-70組ACE07630半乳糖+HSP70組ABE02860半乳糖+EGFP組ABC003130半乳糖+NS組ABCF001123

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，與半乳糖+EGFP組比較，EP<0.05，F(xiàn)P>0.05。

表4實(shí)驗(yàn)第30天各組大鼠晶狀體混濁程度

組別混濁度ⅠⅡⅢⅣⅤNS組 BCE80000半乳糖+α-70組 ACE00431半乳糖+HSP70組ABE00152半乳糖+EGFP組ABC00017半乳糖+NS組ABCF00008

注：與NS組比較，AP<0.05；與半乳糖+ α-70組比較，BP<0.05；與半乳糖+HSP70組比較，CP<0.05，與半乳糖+EGFP組比較，EP<0.05，F(xiàn)P>0.05。

2.2 外源基因表達(dá)的綠色熒光蛋白鑒定 NS組與半乳糖+NS組未見(jiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)(圖2A)；半乳糖+α-70組(圖2B)、半乳糖+HSP70(圖2C)、半乳糖+EGFP組(2D)均可直接觀察到大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中有綠色熒光，只是熒光強(qiáng)度不同。綠色熒光的平均熒光強(qiáng)度利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測(cè)得(見(jiàn)表5)，半乳糖+α-70組的平均熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，與其他4組相比有明顯差異(P<0.01)；半乳糖+EGFP組與半乳糖+HSP70組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；NS組與半乳糖+NS組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，這兩組幾乎沒(méi)有綠色熒光，所測(cè)得的平均熒光強(qiáng)度都為0，明顯低于其他3組(P<0.01)。

時(shí)間(d)NS組 半乳糖+α-70組半乳糖+ HSP70組半乳糖+ EGFP組半乳糖+NS組70cd35.19±4.87ad14.63±3.98ace17.75±4.99ac0bcd140cd77.01±7.53ad36.12±5.11ace31.12±7.23ac0bcd210cd102.45±9.45ad 54.43±6.39ace51.80±5.82ac0bcd300cd140.91±12.41ad75.45±6.46ace72.58±7.11ac0bcd

注：與NS組比較，aP<0.01，bP>0.05；與半乳糖+ α-70組比較，cP<0.01；與半乳糖+EGFP 組比較，dP<0.01，eP>0.05。

注：A、B、C、D、E分別表示NS組、半乳糖+α-70組、半乳糖+HSP70組、半乳糖+EGFP組、半乳糖+NS組；1、2、3、4分別表示第7、14、21、30 d。 圖1 裂隙燈觀察晶狀體混濁度的主要變化

注：A:為NS組和半乳糖+NS組；B:為半乳糖+α-70組、C:為半乳糖+HSP70組、D:為半乳糖+EGFP組。 圖2 第30天時(shí)熒光顯微鏡下觀察結(jié)果(×100)

3 討論

白內(nèi)障表現(xiàn)為晶狀體特定的區(qū)域或完全的混濁化[5]。維持晶狀體的透明度對(duì)保護(hù)視功能有重大意義。晶狀體比較特殊，無(wú)血管，無(wú)神經(jīng)，只能從周?chē)姆克袛z取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此,不利于環(huán)境對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)整,容易遭到損害。αA晶體蛋白僅局限于晶狀體內(nèi)表達(dá)，其它組織僅有少量被發(fā)現(xiàn)[6]。

研究表明，晶狀體中α-晶體蛋白含量隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)逐漸減少，高相對(duì)分子量蛋白質(zhì)可能發(fā)生翻譯后修飾改變，構(gòu)象發(fā)生改變后形成大量的α- 晶體蛋白聚合物，導(dǎo)致分子伴侶功能下降，對(duì)其他晶體蛋白和酶的保護(hù)作用也相應(yīng)下降，加劇其他晶體蛋白的凝聚和光散射[7]，從而形成白內(nèi)障。也有研究表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，晶狀體囊膜中HSP含量逐漸減少，晶體上皮細(xì)胞HSP的表達(dá)量減少反映了晶狀體細(xì)胞自我修復(fù)功能的下降，可引起變性蛋白的恢復(fù)障礙和降解速度減慢，使晶狀體的透明度降低，從而導(dǎo)致老年性白內(nèi)障的形成，可見(jiàn)晶體上皮細(xì)胞內(nèi)起分子伴侶作用的物質(zhì)受損或降低也是導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生的主要因素之一。HSP70是HSP其中一員，它在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，而應(yīng)激后表達(dá)會(huì)顯著性的增強(qiáng)。李桂榮等[8]等通過(guò)研究表明HSP70的應(yīng)激表達(dá)對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞起著重要的保護(hù)作用。Massey等[9]研究表明外源基因?qū)胙蹆?nèi)后，可檢測(cè)到晶狀體內(nèi)有相應(yīng)蛋白表達(dá)。因此，本研究小組在前期已構(gòu)建了αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子(αACP)與HSP70基因融合表達(dá)載體(即pαACP-HSP70)[10]，并將質(zhì)粒導(dǎo)入體外培養(yǎng)的半乳糖性白內(nèi)障大鼠晶狀體組織中，結(jié)果顯示外源性pαACP-HSP70在體外培養(yǎng)的大鼠晶狀體內(nèi)有表達(dá)，及其對(duì)大鼠半乳糖性白內(nèi)障的形成有延緩作用。本實(shí)驗(yàn)從體外研究進(jìn)一步發(fā)展到體內(nèi)研究，將質(zhì)粒導(dǎo)入半乳糖性白內(nèi)障大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示裂隙燈觀察半乳糖+α-70組與半乳糖+HSP70組白內(nèi)障出現(xiàn)的時(shí)間與其他組相比明顯延遲，測(cè)得的平均熒光強(qiáng)度也比其他組高(P<0.05)，且半乳糖+α-70組比半乳糖+HSP70組程度更輕，半乳糖+α-70組平均熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。之所以半乳糖+α-70組比半乳糖+HSP70組作用明顯。我們推測(cè)可能的原因是：由于pαACP-HSP70中含有αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子，它能夠促進(jìn)其下游的HSP70定向的表達(dá)，從而使HSP70含量增加。證明外源HSP70已定向在大鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)有表達(dá)，并且發(fā)揮了其分子伴侶的功能，能防止蛋白質(zhì)變性和降解，并能使聚集的蛋白質(zhì)解聚,從而保證了晶狀體的透明度，延緩了大鼠半乳糖性白內(nèi)障的形成。

白內(nèi)障是當(dāng)今世界致盲的主要眼病。國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在積極探索治療白內(nèi)障的有效方法。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，白內(nèi)障的基因治療已受到人們的重視，經(jīng)過(guò)不懈的努力,我們發(fā)現(xiàn)HSP70有阻止晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)在保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面也起著重要作用。采用基因治療的方法，通過(guò)導(dǎo)入外源的HSP70或誘導(dǎo)自身HSP70基因表達(dá)，從而抑制白內(nèi)障形成，這為治療白內(nèi)障提供新的研究方法和思路。

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