魏芳等

摘 要 提出一種橡膠樹樹皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量測定方法。取樣測定范圍為10～200 mg，利用80%乙醇浸提提取可溶性糖，硫酸蒽酮法測定可溶性糖含量，硝酸鈣法提取淀粉，I2-KI法測定淀粉含量。本方法優(yōu)點(diǎn)是：取樣量小，對膠樹傷害小，取樣過程簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞 橡膠樹 ；非結(jié)構(gòu)性碳水化合物 ；可溶性糖 ；淀粉

分類號(hào) S794.1

A Method for Measuring Soluble Sugars and Starch in Bark

and Xylem of Rubber Tree

WEI Fang1） ZHENG Qiankun2） LUO Shiqiao1）

QIU Jian1） YANG Wenfeng1） WU Ming1） XIAO Xianzhou1，2）

（1 Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China；

2 College of Agriculture， Hainan University， Haikou， Hainan 570288， China）

Abstract A method for measurements of non-structural carbohydrates in bark and xylem of rubber tree was put forward in this study. The measuring sample was within 10-200mg， soluble sugars extracted by 80% ethanol and measured by Sulfuric acid-anthrone method， and starch extracted by Ca（NO3）2 method and measured by I2-KI. Merits of this study： little sample with little hurt to rubber tree， simple operating and accurate data.

Keywords rubber tree ； non-structural carbohydrates ； soluble sugars ； starch

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物（non-structural carbohydrates，NSC）是光合作用的主要產(chǎn)物，包括可溶性糖（如蔗糖、葡萄糖、果糖等），以及儲(chǔ)藏的淀粉和脂類。一旦被同化，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物被分配用于植物本身代謝、新組織生長、產(chǎn)生保護(hù)性化合物，或者儲(chǔ)存以備后用[1-2]。當(dāng)植物對碳水化合物的需要超過光合作用的供應(yīng)后，儲(chǔ)藏的NSC將會(huì)提供必要的緩沖，這種情況例如，在夜間無光合作用時(shí)，休眠季節(jié)或者環(huán)境壓力和面對傷害時(shí)[3]。成年樹木包括大量NSC[4]，數(shù)量是可以頂蓋植物葉子重新生長的幾倍之多[5-6]，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，NSC的儲(chǔ)藏是一個(gè)被動(dòng)的過程，認(rèn)為在這個(gè)過程中滿足植物需求之后多余的碳源才會(huì)被儲(chǔ)藏[1]。然而，NSC的儲(chǔ)藏也可以看做是一個(gè)主動(dòng)的過程，這個(gè)過程中，NSC根據(jù)生長價(jià)值進(jìn)行分配，這也是一種進(jìn)化適應(yīng)，這種適應(yīng)是長期應(yīng)對不同的氣候、疾病或者其他外界打擾的壓力所形成的[7]。

巴西橡膠樹是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值、依靠結(jié)構(gòu)獨(dú)特乳管系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)膠的多年生熱帶高大喬木，橡膠生物合成是其乳管中最主要的代謝活動(dòng)，其生產(chǎn)的天然橡膠（順式多聚異戊二烯）有重要的商業(yè)、國防和交通工業(yè)原料。在橡膠樹中NSC主要儲(chǔ)藏形勢是淀粉，淀粉的動(dòng)員對于膠乳再生和補(bǔ)償持續(xù)割膠傷害有不可忽略的作用。木質(zhì)部中淀粉可以看做一種長效儲(chǔ)存源，而樹皮中淀粉只是作為即時(shí)的緩沖。木質(zhì)部中的可溶性糖作為一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)庫，樹皮中的可溶性糖可以被看做一種中間的、隨時(shí)準(zhǔn)備被使用的儲(chǔ)藏[8]。一直以來，由于淀粉并不是合成橡膠的直接原材料，關(guān)于淀粉方面的研究較少。近年來發(fā)展起來的刺激割膠大大提高了橡膠產(chǎn)量，但是由于割膠強(qiáng)度較大，不可避免的需要?jiǎng)訂T儲(chǔ)藏碳庫來提供原料供應(yīng)，這個(gè)過程中淀粉的作用不可忽略。淀粉的積累和消耗的動(dòng)態(tài)變化情況對于割膠刺激劑的施用和割膠強(qiáng)度的調(diào)整有重要的意義，是重要的割膠理論基礎(chǔ)。在此條件下掌握橡膠樹樹皮和木質(zhì)部的可溶性糖和淀粉提取和測定方法是解決這項(xiàng)工作的前提。

目前，人們對于樹木淀粉提取的研究較少，在我國，20世紀(jì)80年代初期梁尚樸對橡膠樹樹木的淀粉含量進(jìn)行過測定，由于條件限制，當(dāng)時(shí)使用割膠后的樹皮直接染色后按照顏色深淺分級(jí)，肉眼分辨淀粉的等級(jí)，該方法沒有將淀粉含量定量，也沒有測定木質(zhì)部淀粉含量。對木本植物淀粉研究較少，在國外，加拿大研究人員對于楊樹和松樹的葉子和根的淀粉進(jìn)行提取和測定，采用的是酶解的方法[9]，由于該方法操作過程步驟較多，花費(fèi)時(shí)間長，需要的樣品量較多，對于橡膠樹而言，樹皮是割膠的保證，盡量保護(hù)試驗(yàn)用樹也是保障后續(xù)試驗(yàn)?zāi)茼樌M(jìn)行的基礎(chǔ)，因此，所述方法并不適合于橡膠樹的樹木淀粉檢測。建立橡膠樹樹皮和木質(zhì)部非結(jié)構(gòu)性碳水化合物提取及含量測定方法，盡量減少取樣過程中對樹皮的傷害成為本領(lǐng)域需要解決的技術(shù)問題，目前，關(guān)于這方面的技術(shù)成果，并未見諸報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年7月10號(hào)對中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)場七隊(duì)定植于1982年的一顆無性系PR107取樣，選擇離地面不同高度處割面一側(cè)取樹皮和木質(zhì)部。

1.2 方法endprint

1.2.1 取樣

取樣橡膠樹樹皮用直徑0.5 cm小型打孔器，直接用手將打孔器戳進(jìn)樹皮內(nèi)，從樹皮中取出相應(yīng)樹皮，作為樹皮樣品；再在樹皮取樣口用小型電鉆在木質(zhì)部打孔部位鉆孔取樣木屑，作為木質(zhì)部樣品，鉆孔深度為3.0 cm。

1.2.2 可溶性糖提取和測定

分別對樹皮和木質(zhì)部樣品液氮研磨，烘干后取10～200 mg，0.5～4 mL 80%乙醇80℃浸提40 min，中間斡旋攪拌，12 000 r/min離心10 min，收集上清，殘?jiān)?0%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10 mg，80℃脫色30 min，離心后取清液定容至10 mL，分別獲得樹皮和木質(zhì)部的可溶性糖提取液；取100 μL加入3 mL硫酸-蒽酮試劑，90℃保溫15 min，冷卻至室溫后626 nm處測定光吸收。

1.2.3 淀粉提取和測定

將提取可溶性糖后的樹皮和木質(zhì)部沉淀殘?jiān)謩e用2 mL 80%Ca（NO3）2溶液沸水浴5 min浸提，4 000 r/min離心5 min，收集上清，殘?jiān)? mL80%Ca（NO3）2沖洗一次，離心收集上清，合并提取液，分別獲得樹皮和木質(zhì)部淀粉提取液。提取液2 mL，加入100 μL I2-KI溶液，在580 nm處測定光吸收。

1.2.4 可溶性糖和淀粉測定方法及最大光吸收測定

配置80%乙醇溶液及濃度為1 mg/mL的葡萄糖（還原性糖）和蔗糖（非還原性糖）溶液；150 mg蒽酮溶于100 mL稀硫酸（70 mL濃硫酸加30 mL水）配制成蒽酮試劑。蔗糖與葡萄糖溶液按比例混合（混合比例如下表），混合液100 μL加入3 mL蒽酮試劑，90℃保溫15 min，冷卻至室溫后在300～900 nm掃描光吸收。

1.2.5 可溶性糖和淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

用硫酸-蒽酮法測定不同濃度梯度可溶性糖在626 nm光吸收下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取的可溶性糖濃度分別為：0、200、300、400、600、800、1 000 μg/mL，取100 μL加入3 mL硫酸-蒽酮試劑，90℃保溫15 min，冷卻至室溫后626 nm處測定光吸收。以光吸收測定值為橫坐標(biāo)，可溶性糖濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

不同濃度（0、50、100、200、300、400 μg/mL）淀粉溶液2 mL，加入100 μL I2-KI溶液，在580 nm處測定光吸收，以光吸收測定值為橫坐標(biāo)，淀粉溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選取一株膠樹進(jìn)行可溶性糖和淀粉含量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸蒽酮法測定可溶性糖最大光吸收峰

從表1中可以看出，采用硫酸蒽酮法測定可溶性糖含量光吸收在626 nm合適。由于淀粉的溶液的成分單一，本文默認(rèn)反應(yīng)液的最大光吸收峰在580 nm處。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 樹皮和木質(zhì)部可溶性糖和淀粉含量

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，選取一株膠樹進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在測定區(qū)間范圍內(nèi)，以上數(shù)據(jù)可信度高。根據(jù)圖3的樣品可溶性糖和淀粉濃度含量進(jìn)行比較分析，由于割線位于地上1 m左右，無論是樹皮還是木質(zhì)部，割線處可溶性糖含量顯著高于非割線處，說明在割線處產(chǎn)膠潛力最大，也間接說明割膠引起了可溶性糖向割線處聚集；其次，被測膠樹的樹皮中淀粉含量顯著低于木質(zhì)部中淀粉含量，說明木質(zhì)部內(nèi)淀粉作為長效儲(chǔ)存源含有較多的淀粉，而樹皮中淀粉只是作為即時(shí)的緩沖；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該取樣樹已經(jīng)割膠20年，雖然已進(jìn)入老齡但是對比淀粉和可溶性糖含量，該樹在現(xiàn)階段的常規(guī)割膠制度下仍有產(chǎn)膠潛力，可以持續(xù)割膠。

3 討論

傳統(tǒng)的I2-KI測定方法多用于測定產(chǎn)淀粉植物中的淀粉，在進(jìn)行橡膠樹樹皮和木質(zhì)部淀粉測定過程中，由于色素的影響，提取液數(shù)據(jù)重復(fù)性差，本方法在此基礎(chǔ)上添加了活性炭，并對活性炭添加質(zhì)量和脫色時(shí)間及條件也進(jìn)行了摸索，認(rèn)為10 mL體積內(nèi)，加入10 mg活性炭，80℃高溫脫色30 min以上效果最好。根據(jù)橡膠樹木質(zhì)部和樹皮淀粉含量的范圍，對提取和測樣體積也進(jìn)行了摸索，10～200 mg樣品，可溶性糖提取體積在10 mL以內(nèi)，測樣體積100 μL，淀粉提取體積在10 mL內(nèi)，測樣體積2 mL。對樹皮和木質(zhì)部的可溶性糖提取后的殘?jiān)驮紭悠愤M(jìn)行淀粉提取后發(fā)現(xiàn)，兩種方法淀粉含量差別無幾，所以用殘?jiān)M(jìn)行淀粉提取更方便更節(jié)約樹皮。

割膠使得橡膠樹不僅需要補(bǔ)充乳管膠乳的再生，同時(shí)橡膠樹還需要承受割膠造成的持續(xù)傷害，傷害引起的脅迫增加了膠樹的呼吸作用，也需要消耗碳水化合物[10]。Silpi U.等[11]研究表明所有開割后的膠樹，儲(chǔ)藏的增加伴隨的是膠樹樹干生長的顯著降低，儲(chǔ)藏的碳源能量被用于膠乳再生和補(bǔ)償割膠引起的持續(xù)傷害 。另一方面，Chantuma P.等[8]認(rèn)為割膠也使得樹干積累更多的非結(jié)構(gòu)性碳源，淀粉在樹皮中的含量低于樹干，但是可溶性糖含量反而是樹皮高于樹干，雖然膠乳再生發(fā)生在樹皮，但與割膠緊密相關(guān)的是樹干的淀粉含量而不是樹皮。該研究還認(rèn)為儲(chǔ)藏淀粉的動(dòng)態(tài)變化可以作為評價(jià)割膠制度的一個(gè)相關(guān)參數(shù)。鑒于種種研究，我們認(rèn)為對橡膠樹樹干可溶性糖和淀粉含量規(guī)律是重要的割膠理論基礎(chǔ)，在此前提下，本文確定了一種微量取樣測定橡膠樹樹皮和木質(zhì)部淀粉和可溶性含量的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于只需要在不傷害橡膠樹割膠的基礎(chǔ)上，取少量樹皮和木質(zhì)部（最低取樣10 mg）進(jìn)行可溶性糖和淀粉含量測定，對橡膠樹的樹皮和木質(zhì)部傷害較小，而橡膠樹的耗皮是橡膠樹穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的保證，節(jié)約橡膠樹耗皮量可以延長割膠時(shí)間，提高橡膠樹經(jīng)濟(jì)價(jià)值；能夠快速獲得樹皮和木質(zhì)部中蔗糖和淀粉的含量，為每年開割初期準(zhǔn)確確定橡膠樹開割時(shí)間、制定不同無性系橡膠樹在植膠區(qū)不同物候下的含量標(biāo)準(zhǔn)、評價(jià)橡膠樹割膠潛力提供技術(shù)支持，與淀粉酶解法相比，不僅步驟簡單，耗時(shí)短，而且對橡膠樹傷害小，實(shí)際應(yīng)用時(shí)具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。endprint

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