黃小燕，潘 裕，樊海艇，張超超，湯家銘，蔡貞貞

(上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201202)

綜述與專論

大鼠、小鼠微生物學質(zhì)量監(jiān)測中的哨兵動物設(shè)置

黃小燕，潘 裕，樊海艇，張超超，湯家銘，蔡貞貞

(上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201202)

建立并執(zhí)行全面的實驗動物質(zhì)量監(jiān)測，對于確保人員、動物健康和福利，以及實驗研究結(jié)果的真實性、有效性和可重復性是非常重要的。在實驗動物中設(shè)置相應(yīng)的哨兵動物能有效監(jiān)測實驗動物質(zhì)量。本文對實驗動物微生物質(zhì)量監(jiān)測中哨兵鼠選擇，哨兵鼠與被監(jiān)測動物接觸方式、時間，哨兵鼠放置位置，每籠哨兵鼠代表被監(jiān)測群體的鼠籠數(shù)，以及檢測數(shù)量、檢測頻率和項目做一綜述。

哨兵動物；微生物；微生物學監(jiān)測；大鼠；小鼠

實驗動物微生物學和寄生蟲學質(zhì)量控制是實驗動物質(zhì)量控制的重要一環(huán)。近幾十年來，實驗動物的微生物學和寄生蟲學質(zhì)量有了顯著的提高，但不論在實驗動物生產(chǎn)階段還是在動物實驗階段，時而還有一些對人類和/或動物健康以及對動物實驗研究有影響的病原體在實驗動物中流行[1]。因此建立并執(zhí)行全面的實驗動物質(zhì)量監(jiān)測，對于確保人類健康、動物健康、動物福利以及實驗研究結(jié)果的真實性、有效性和可重復性是非常重要的。

實驗動物微生物學和寄生蟲學質(zhì)量監(jiān)測可分為生產(chǎn)繁殖群的質(zhì)量監(jiān)測和進入動物實驗階段的質(zhì)量監(jiān)測，前者一般采用隨機抽樣檢測的方法[國標GB14922.2-2011實驗動物微生物學等級及監(jiān)測]，而后者則通過設(shè)置“哨兵動物”的方法。所謂的“哨兵動物”(sentinel animal)是指為微生物監(jiān)測所設(shè)置的指示動物。在鼠群中放置哨兵鼠，盡可能地讓這些哨兵鼠暴露給動物群體和設(shè)施中的微生物，然后從哨兵鼠采血、取樣進行檢測，用檢測結(jié)果來反映動物群體的微生物感染狀況，而不干擾正在進行的動物實驗。本文主要對實驗動物微生物質(zhì)量監(jiān)測中哨兵鼠的設(shè)置做一綜述。

1 哨兵鼠的選擇

哨兵鼠一般選擇免疫反應(yīng)正常的封閉群動物，因封閉群動物易得，且價廉，對病原體易感但抵抗力強，能產(chǎn)生很好的免疫學應(yīng)答。SD大鼠和ICR小鼠都屬于封閉群，適宜做哨兵鼠。Lipman等[2]認為，哨兵鼠選擇雌性動物為宜，既可減少動物的打斗，又可避免對種群因計劃外的交配而造成遺傳學污染。

哨兵鼠選擇適齡動物，一般在3～5周齡時引入，飼養(yǎng)6～8周后進行檢查。哨兵鼠引入時應(yīng)同時處死若干，保留血清或其他樣品作為哨兵鼠的背景資料。應(yīng)注意避免使用太老的動物作為哨兵鼠，因為可能導致血清學假陰性。

除特殊監(jiān)測需要之外，哨兵動物一般來源于與被監(jiān)測動物同一種屬的SPF 級動物，如小鼠飼養(yǎng)室用小鼠哨兵，大鼠飼養(yǎng)室用大鼠哨兵。如一個飼養(yǎng)室內(nèi)同時飼養(yǎng)大小鼠，則需要同時設(shè)大小鼠哨兵，因為大小鼠的一些病毒感染譜不盡相同。

裸小鼠等免疫缺陷動物感染病原體后抗體生成低下，血清學試驗常呈陰性，因此，不論是生產(chǎn)繁殖還是用于動物實驗，都應(yīng)設(shè)置免疫功能正常的SPF動物作為“哨兵”，定期處死采血檢查以監(jiān)視裸鼠群中某些病原體的感染。

2 接觸方式

哨兵鼠與被監(jiān)測動物接觸方式有兩種：一是直接接觸法，二是“臟墊料”法。直接接觸法感染哨兵鼠，可選用毛色上不同或種群中的其它動物作為哨兵鼠。將哨兵鼠和被監(jiān)測動物種群合養(yǎng)，多用于檢疫期和小群體的健康監(jiān)測[3]。但是這樣做的風險在于，可能引起被監(jiān)測動物與哨兵鼠打斗，而且很難采集很多籠的鼠進行檢測[4]。

通常，哨兵鼠與被監(jiān)測動物接觸采用“臟墊料”法[5]，即在更換墊料時采集部分所要監(jiān)測動物使用過的墊料，特別是疑似感染的動物的臟墊料，放置到哨兵鼠籠內(nèi)，如臟墊料中有病原體，就會感染哨兵動物。哨兵動物使用的墊料中臟墊料至少占50%，也可以100%使用臟墊料[6]。Compton 等報道應(yīng)用這種方法在空氣和墊料污染的哨兵鼠中能有效地檢測到鼠類病原體，并且接觸頻率和“舊墊料”的稀釋度可以影響傳播效果[7]。當然，臟墊料法也存在一些缺陷，例如纖毛相關(guān)呼吸道桿菌和乳酸脫氫酶增高癥病毒就不通過臟墊料傳播，仙臺病毒和螺旋桿菌也不能很好地通過墊料傳播[8]。

適齡哨兵鼠在飼養(yǎng)單元中放置4-6周，讓這些哨兵鼠充分地暴露給被監(jiān)測動物群體或動物房中的病原，以便檢測微生物抗體和寄生蟲。哨兵鼠放置在群體中的時間不宜超過3個月，因為小鼠細小病毒的易感性隨年齡增長而下降[8]。

3 籠盒數(shù)

“臟墊料”法中，哨兵動物代表的是其使用的臟墊料的那些實驗動物籠。哨兵動物和其所“代表”的群體動物的比例沒有相關(guān)的標準；通常大鼠每籠代表不超過10籠，小鼠每籠代表10～20籠[7]。但也有報道，開架飼養(yǎng)和層流柜飼養(yǎng)小鼠時，“臟墊料”法最多可以監(jiān)測34個籠位，少于35個籠子的飼養(yǎng)架宜放置一個哨兵籠；飼養(yǎng)大鼠和地鼠時，在飼養(yǎng)架的底層每側(cè)放置一個哨兵籠，最多可以監(jiān)測24～30個籠子[3,9]。

在實際操作中應(yīng)該平衡一下風險和費用的關(guān)系。例如，在檢測中發(fā)現(xiàn)哨兵鼠檢測陽性，如果1個哨兵鼠籠代表10～20籠鼠(哨兵鼠使用量多且檢測費用高)，為找出是哪籠鼠出了問題可能需要對10～20籠的動物分別檢測；如果1個哨兵鼠籠代表50～80 籠鼠(哨兵鼠使用量少且檢測費用低)，為找出是哪籠鼠出了問題則可能需要對50-80 籠的動物分別檢測。

4 哨兵鼠擺放位置和數(shù)量

哨兵鼠籠的放置位置應(yīng)考慮盡量增大這些動物可能的感染機會，如和群體中的動物接近、放在籠架底層、離出風口近等。一般哨兵鼠籠以籠架對角線放置，籠架底部兩側(cè)放置[9]，定期更換墊料；有將哨兵鼠籠僅放置在中間籠架的中間位置，每周兩次固定時間更換包括哨兵鼠在內(nèi)的飼養(yǎng)鼠墊料[10]；還有些單位每個房間放置一個哨兵鼠籠，通過定期更換鼠籠墊料和位置使哨兵鼠充分暴露在墊料和環(huán)境空氣中。

因同年齡的鼠放在一個籠子里，其微生物狀態(tài)會大致一致，所以一般每籠放置2-4只哨兵鼠。對哨兵鼠籠內(nèi)的動物隨機選擇一只檢測，其他的哨兵鼠飼養(yǎng)至有檢測結(jié)果。如果檢測結(jié)果為陽性，余下的可以去驗證陽性結(jié)果；如果檢測結(jié)果為陰性，余下的哨兵鼠實施安樂死，也可以采樣用于檢測其它感興趣的但尚未檢測的病原(即未列在上次檢測計劃中的病原等)。

FELASA(歐洲實驗動物學會聯(lián)盟)建議對重要病原至少每季度監(jiān)測一次。國內(nèi)通用的檢測頻率也是每季度檢測一次，當然也可根據(jù)各地的環(huán)境和研究需要增加檢測的頻率。在經(jīng)常引入新動物的設(shè)施，與不常有新進動物的設(shè)施相比較，則監(jiān)測頻度可能要適度地提高。一般性的原則是，高頻度的小樣本監(jiān)測(如每4～6周檢測3～5個動物)比低頻度的大樣本監(jiān)測(如每3個月監(jiān)測10個動物)更可靠[8]。

根據(jù)以上每個哨兵鼠籠盒中哨兵鼠的只數(shù)、擺放位置，檢測頻率，各實驗動物研究生產(chǎn)單位可估算出每年所需哨兵動物數(shù)量。

5 檢測項目

檢測項目主要的依據(jù)是現(xiàn)行版的GB 14922.2-2011《實驗動物微生物學等級及監(jiān)測》。而國際上不同組織對微生物的質(zhì)量檢測標準不同。如對SPF級大小鼠病毒檢測必須檢測項目和必要時檢查項目國家標準合計要求14種，國際實驗動物科學理事會(International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)要求17種。國家標準比ICLAS少的三種病毒分別為：輪狀病毒(rotavirus，RV)，巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)和乳酸脫氫酶增高病毒(lactate dehydrogenase elevating virus，LDV)。

對SPF級大小鼠細菌檢測必須檢測項目和必要時檢查項目國家標準要求16種，ICLAS要求13種。其中ICLAS包含GB中的10種，但對國家標準內(nèi)的假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)、念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)、乙型溶血性鏈球菌(β-hemolytic streptococcus)等不作強制要求，而多出了其他3種細菌：螺桿菌屬(Helicobacter.spp)，纖毛相關(guān)呼吸道桿菌(Cilia-associatedrespiratoryBacillus，CAR)和檸檬酸桿菌(CitrobacterWerkmanandGillen)。

由于哨兵動物的設(shè)置和管理沒有統(tǒng)一的國際標準或指導性文件，每個單位應(yīng)該根據(jù)動物飼養(yǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)數(shù)量不同而有所區(qū)別。哨兵鼠的選用依實際而定，設(shè)置不是一成不變的。使用哨兵鼠需要遵從兩個要點，一是保證足夠檢測數(shù)量的同時使用最少量的哨兵鼠，二是在整個監(jiān)測過程中要使哨兵鼠最大限度的暴露于潛在的病原感染環(huán)境中。

建立哨兵動物的微生物檢測體系旨在加強動物實驗過程的管理，及時有效控制病原體的傳播；對哨兵動物的檢測結(jié)果可以促進、完善有關(guān)的動物實驗管理制度，預防類似的病原體感染情況的再次發(fā)生。

[1] 陸嘉琦, 劉吉宏, 周艷, 等. 淺談實驗動物飼養(yǎng)管理和使用計劃中“災(zāi)難計劃”的制定和實施[J].中國比較醫(yī)學雜志, 2014, 24(4):78-82.

[2] Lipman NS,Homberger FR. Rodent quality assurance testing:use of sentinel animal systems [J]..Lab Animal,2003,32:36-43.

[3] 李雨函, 魏強.哨兵動物概述 [J].中國比較醫(yī)學雜志, 2012, 22(10):72-75.

[4] Rehg JE,Toth LA. Rodent quarantine programs: purpose，principles，and practice [J]. Lab Anim Sci,1998,48:438-447.

[5] Thigpen J E,Lebetkin EH,Dawes ML, et al. The use of dirty bedding for detection of murine pathogens in sentinel mice[J]. Lab Anim Sci,1989,39:324-327.

[6] University of Missouri at Kansas City-UMKC,Laboratory animal research core. Rodent Sentinel Program[S]. 2003.

[7] Compton SR, Homberger FR,Paturzo FX,et al. Efficacy of three microbiological monitoring methods in a ventilated cage rack[J]. Comp Med,2004,54:382-92.

[8] 龐萬勇, 賀爭鳴, 何誠, 等.實驗鼠群的健康監(jiān)測管理 [J].中國比較醫(yī)學雜志, 2011, 21(10):87-93.

[9] University of Wisconsin-Madison. Rodent colony health monitoring program policies and placement procedures[S]. 2011.

[10] 馬元元, 孔申申, 陶迎紅, 等.實驗動物設(shè)施內(nèi)哨兵鼠對病原菌監(jiān)控的研究 [J]. 實驗動物科學[J]. 2012, 29(4):25-28.

Use of sentinel animals for the microbiological monitoring program in laboratory rats and mice

HUANG Xiao-yan, PAN Yu, FAN Hai-ting, ZHANG Chao-chao, TANG Jia-ming, CAI Zhen-zhen

(Experiment Center for Science and Technology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

It is very important to establish and execute the all-sided experimental animal quality monitoring in order to guarantee human health, animal health and welfare as well as the authenticity, validity, and repeatability of the experimental research results. Setting corresponding sentinel animals in the experiment can effectively monitor the quality of experimental animals. This article gives a general review of the selection of sentinel rats in the microbiological quality monitoring of the experiment animals, contact form and time between the sentinel rats and the rats being monitored, the placement of sentinel rats, and the number of rat cages being monitored by each cage of sentinel rats, as well as the test quantity, test frequency and the project.

Sentinel animals; Microorganisms; Microbiological monitoring program; Rats; Mice

上海中醫(yī)藥大學預算內(nèi)項目(編號：A1-20140367)。

黃小燕(1982-)，職稱：助理研究員，主要研究方向：實驗動物、中藥藥理，E-mail:huangxiaoyan8211@163.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0067-03

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.015

2014-06-06