常建梅，崔貞玉，韓素霞，郭李平

0 引言

心肌缺血(Ischemic cardiomyopathy,ICM)具有高發(fā)病率、高病死率，嚴(yán)重危害著人類(lèi)健康，已成為危害人類(lèi)健康的主要疾病之一。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2020年，全世界因冠心病所致死亡人數(shù)將高達(dá)1 110萬(wàn)人[1]。近年來(lái)，我國(guó)冠心病的發(fā)病率增高，且呈年輕化趨勢(shì)。心肌缺血隨著病情的發(fā)生發(fā)展最終發(fā)生心絞痛、心肌梗死、心律失常和心功能下降，嚴(yán)重持久的心肌缺血可致心肌梗死，甚至伴發(fā)梗死后惡性心律失常，有導(dǎo)致猝死的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)驗(yàn)證氯沙坦對(duì)大鼠心肌缺血后ACE2表達(dá)的影響，探討氯沙坦改善大鼠心肌缺血預(yù)后的新的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 SPF級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體重220～240 g(新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.2 主要材料及儀器 氯沙坦(默沙東制藥有限公司，科素亞)；小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；電子顯微鏡(上海蔡司光學(xué)儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司)；高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Thermo Fhisher)；PB303-N型電子精密天平(德國(guó)Thermo Fhisher)；LD4-2型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；粉碎勻漿機(jī)(美國(guó)Bio-Rad)；RIPA裂解液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；PMSF(武漢博士德生物有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；電泳膠(美國(guó)NUPAGE)；NC膜(北京中杉金橋)；蛋白預(yù)染Marker(北京中杉金橋，分子量19～118 KD)。XJ-75S脫色搖床(北京生物儀器公司)；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad)；Power WaveX340型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK)；NU-6832E型低溫冰箱(德國(guó)Thermo Fhisher)；90-1型磁力雙向攪拌器(德國(guó)Thermo Fhisher)；SH-100型凝膠圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad)。

1.3 動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本的采集 建立心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停捍笫蟾骨宦樽砗?，?號(hào)可吸收線(xiàn)在距左心耳2～3 mm處部分結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，使其狹窄；假手術(shù)組只在相同位置造成損傷但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。

將心肌缺血模型術(shù)后24 h存活的42只大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組(sham，n=6)；14 d模型組(14 d mod，n=6)；28 d模型組(28 d mod，n=6)；14 d小劑量氯沙坦干預(yù)組[14 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，14 d大劑量氯沙坦干預(yù)組[14 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]；28 d小劑量氯沙坦干預(yù)組[28 d losa lo，10 mg/(kg·d)，n=6]，28 d大劑量氯沙坦干預(yù)組[28 d losa hi，30 mg/(kg·d)，n=6]。小劑量氯沙坦按10 mg/(kg·d)灌胃給藥，大劑量氯沙坦組按30 mg/(kg·d)灌胃給藥，假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水灌胃，各組動(dòng)物灌胃總?cè)萘烤鶠?00 g<2 mL。

標(biāo)本的采集：大鼠腹腔麻醉后，打開(kāi)胸腔，迅速取出心臟，置于冰上預(yù)冷的生理鹽水中洗去血液，濾紙吸干水分。切取左心室心肌缺血區(qū)域一分為二，一部分組織置于4%多聚甲醛中，HE染色觀察其心肌缺血后的病理變化，另一部分組織保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 ACE2蛋白表達(dá) Western blotting法檢測(cè)ACE2蛋白的表達(dá)：蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，定量后各組取45 μg蛋白行SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，0.35 mA恒流轉(zhuǎn)膜5 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別用ACE2抗體(1∶1 000，92 KD，兔抗)、β-acting抗體(1∶200，47 KD，兔抗)4 ℃過(guò)夜孵育，0.05% TBST洗膜3次，每次5 min，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h，0.05%TBST洗膜3次，每次5 min。底物DAB呈色法顯色。各蛋白表達(dá)水平經(jīng)全能型凝膠成像分析儀檢測(cè)分析其吸光度值(A值)，并以與內(nèi)參的比值作為半定量指標(biāo)進(jìn)行各組間的比較。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞光鏡下結(jié)構(gòu) HE染色光鏡下可見(jiàn)，假手術(shù)組心肌細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，肌原纖維清晰，排列整齊，橫紋清楚，間質(zhì)纖維無(wú)增生。模型組心肌細(xì)胞胞質(zhì)不均勻紅染或呈不規(guī)則粗顆粒狀，間質(zhì)水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，心內(nèi)膜下心肌細(xì)胞彌漫性空泡樣變性，尚可見(jiàn)完整細(xì)胞核，隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)心肌細(xì)胞萎縮明顯；藥物干預(yù)組光鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)均勻紅染，間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)均較模型組減輕，細(xì)胞核完整，未見(jiàn)心肌細(xì)胞空泡樣變性，呈藥物劑量依賴(lài)性；以4周大劑量組改善最明顯，炎癥范圍及心肌細(xì)胞萎縮面積均較其他組減小。見(jiàn)圖1～圖8。

細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，肌原纖維清晰，間質(zhì)纖維無(wú)增生

心肌細(xì)胞萎縮，空泡變性，炎細(xì)胞浸潤(rùn)

心肌細(xì)胞萎縮，炎細(xì)胞浸潤(rùn)

細(xì)胞將減少，萎縮改變，炎細(xì)胞浸潤(rùn)

細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，肌原纖維清晰，間質(zhì)纖維無(wú)增生

心肌細(xì)胞萎縮 心臟瓣膜軟骨化，炎細(xì)胞浸潤(rùn)

心肌細(xì)胞萎縮，心瓣膜軟骨化生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)

心肌細(xì)胞萎縮，萎縮范圍比其他組減少

2.2 心肌細(xì)胞ACE2蛋白表達(dá)的結(jié)果 Mod組的ACE2表達(dá)高于sham組(P<0.01)，且在1個(gè)月內(nèi)呈時(shí)間依賴(lài)性；氯沙坦組ACE2的表達(dá)明顯高于Mod組，呈劑量依賴(lài)性。即隨著用藥時(shí)間逐漸延長(zhǎng)、劑量逐漸增加，ACE2蛋白表達(dá)逐漸增多。見(jiàn)圖9、圖10。

圖9 各組大鼠左室心肌ACE2與β-acting的蛋白印跡圖

圖10 各組大鼠左室心肌ACE2與β-acting的比值

3 討論

ARB類(lèi)藥物是冠心病治療中可以降低死亡率、改善預(yù)后的藥物之一，可以延緩或抑制心室重構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中：模型組大鼠缺血心肌組織中ACE2蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組升高(P<0.01)，呈時(shí)間依賴(lài)性；氯沙坦進(jìn)一步增加了ACE2蛋白質(zhì)的表達(dá)量，呈劑量依賴(lài)性。即隨著用藥時(shí)間延長(zhǎng)、劑量加大，ACE2蛋白表達(dá)量增高越明顯。模型組的ACE2蛋白表達(dá)較假手術(shù)組高可能是心肌缺血缺氧狀態(tài)下RAS激活，ACE水平升高使AngⅡ水平增高，反饋性地引起ACE2的升高。而氯沙坦組ACE2表達(dá)的增高提示氯沙坦干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，心肌缺血大鼠心肌組織中ACE2蛋白的表達(dá)量越高，越能改善大鼠缺血心肌的缺血狀態(tài)。以往研究表明，RAS的過(guò)度激活在高血壓和心室重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示ACE2可能通過(guò)抑制RAS系統(tǒng)其他成員的過(guò)度激活來(lái)發(fā)揮其改善心肌缺血狀態(tài)的作用。ACE2是Ang1-7的主要催化酶，Ang1-7具有擴(kuò)張血管、降低血壓、利尿、抑制心肌細(xì)胞肥大、抑制血管平滑肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞增殖等作用[4-6]，并可有效拮抗AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)。生物體在生理狀態(tài)下即存在一種自我平衡功能，血管緊張素家族成員內(nèi)部之間也不例外，AngⅠ分別在ACE和ACE2的作用下可以水解產(chǎn)生2種多肽：AngⅡ、Ang1-7，而它們的生理作用完全相反，且達(dá)成新的平衡，這種平衡對(duì)病理狀況下抑制機(jī)體血管重構(gòu)及心肌重塑有著重要的臨床意義。

ACE2在心肌組織中高度表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一新的RAS成員在心血管疾病病理生理中的重要作用。ACE2對(duì)心臟的保護(hù)作用已有眾多研究證實(shí)，有研究者發(fā)現(xiàn)，ARB類(lèi)藥物可增加組織中ACE2的含量，使Ang1-7的水平升高，并認(rèn)為ARB類(lèi)藥物增加ACE2的表達(dá)，使ACE2產(chǎn)物增加擴(kuò)血管、改善微循環(huán)、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增生等治療效應(yīng)[7-8]。以上研究均與本研究結(jié)果相一致。

血管緊張素受體阻斷劑氯沙坦，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合AT1R，使AngⅡ不能與其第一受體結(jié)合，增加了AngⅡ與AT2R結(jié)合的幾率而促進(jìn)AngⅡ與AT2結(jié)合，擴(kuò)張血管，從而改善缺血區(qū)微循環(huán)和逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)的生物功能[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氯沙坦也可以通過(guò)增強(qiáng)缺血心肌組織中ACE2的表達(dá)來(lái)改善心肌的缺血狀態(tài)。推測(cè)氯沙坦是ACE2 表達(dá)上調(diào)的主要原因，即ARB阻斷了AngⅡ與其主要受體AT1R結(jié)合，促使AngⅡ與其受體AT2R結(jié)合的幾率增加，發(fā)揮生物效應(yīng)，同時(shí)，游離AngⅡ也是ACE2的主要作用底物，從而反饋性地增加ACE2的表達(dá)。目前，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)法對(duì)此假設(shè)提供確切的證據(jù)，尚需進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)以上推斷。

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