，

(1.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院 交通與環(huán)境學(xué)院，廣東 深圳 518172；2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境工程系， 廣州 510300)

1 研究背景

賈第鞭毛蟲(Giardia)是寄生于人和動(dòng)物體內(nèi)的一類腸道原蟲。飲用了含有賈第鞭毛蟲的水可引起嚴(yán)重的消化道感染，甚至死亡[1]。由賈第鞭毛蟲引起的疾病稱為賈第鞭毛蟲病(Giardiasis)，常見癥狀為腹瀉、腹痛和消化不良[2]。賈第鞭毛蟲分布于世界各地，近10多年來，由于旅游事業(yè)的發(fā)展，在旅游者中發(fā)病率較高，故又稱“旅游者腹瀉”。起初，人類對(duì)賈第鞭毛蟲的認(rèn)識(shí)還不夠深入，認(rèn)為該蟲只是一種共生性的腸道原蟲。隨著世界各地賈第鞭毛蟲病的相繼暴發(fā)和流行，其危害性不斷顯現(xiàn)，人類才真正開始了對(duì)該寄生原蟲的深入研究。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，全世界人群賈第鞭毛蟲感染率為1%～30%，兒童感染率最高。因此，該寄生原蟲已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為危害人類身體健康重要寄生蟲之一[3]。

近幾年，因?yàn)椴≡⑸镂廴径斐闪餍胁”l(fā)事件不斷發(fā)生，如口蹄疫、SARS、甲型H1N1、禽流感等由病原體引起的流行病造成了大范圍危害和社會(huì)恐慌。水環(huán)境污染或水系傳播而引起的病原體感染仍然是當(dāng)今世界上危害范圍最廣的環(huán)境問題。水媒性病原體主要包括原生動(dòng)物、細(xì)菌和病毒，其中腸道感染病原體引發(fā)的案例最多。因此，我國在2006年12月頒布的新版《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5749—2006)將賈第鞭毛蟲列入需要檢驗(yàn)的微生物指標(biāo)之一[4]。

目前賈第鞭毛蟲常用的滅活包括：氯氣、二氧化氯、臭氧(臭氧/過氧化氫)、紫外線(Ultraviolet，UV)和光催化劑等[5-8]。賈第鞭毛蟲外壁有一層很厚的孢囊對(duì)傳統(tǒng)的加氯消毒有很強(qiáng)的抵抗性[9]，而加大消毒劑量又會(huì)導(dǎo)致水中致癌副產(chǎn)物增加[10]，嚴(yán)重危害人體健康。研究顯示超聲波對(duì)水體中的原聲動(dòng)物有很好的殺滅效果，而且沒有致癌副產(chǎn)物生成，超聲技術(shù)在消毒領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用前景[11]。目前國內(nèi)在此領(lǐng)域研究主要針對(duì)細(xì)菌和大腸菌群等，而鮮見應(yīng)用于水中賈第鞭毛蟲滅活的報(bào)道[12-13]。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)裝置與試驗(yàn)方法

試驗(yàn)裝置如圖1所示，該裝置購于中國科學(xué)院聲學(xué)研究所東海研究站。型號(hào)為TF2460A，可選頻率20,40,60 kHz，功率(0～150)±2 W可調(diào)，容器直徑8 cm，容器高度10 cm。

圖1 超聲反應(yīng)裝置示意圖

反應(yīng)容器置于水浴槽中，控制溫度(25±1)℃，容器中加入蟲樣50 mL，其濃度為3×105個(gè)/mL，調(diào)節(jié)pH 7±0.2，超聲頻率19.8 kHz，超聲功率151 W，反應(yīng)時(shí)間10 min每隔1 min取樣1 mL進(jìn)行檢測(cè)。每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值。

2.2 試驗(yàn)材料

賈第鞭毛蟲(Giardia)采于患病犬，經(jīng)過篩、硫酸鋅漂浮和蔗糖梯度離心等步驟，得到濃度為5.0×106個(gè)/mL賈第鞭毛蟲樣品。以2.5%重鉻酸鉀懸浮保存于4℃冰箱。4,6-二脒基-2-苯基-吲哚(DAPI)，普匹碘胺(PI)，Hanks平衡鹽溶液均購于Sigma (USA)。

2.3 分析方法

2.3.1 熒光染色法

采用熒光染色法[14-16]，所取樣品4℃、10 000 r/min離心5 min，用HBSS平衡溶液漂洗3次；棄上清液于160 μL，加20 μL DAPI、20 μL PI使用液，37℃避光溫浴1 h。取出樣品再用HBSS平衡溶液漂洗3次，將未染上色的DAPI與PI洗掉。處理后樣品涂片，在熒光顯微鏡下鏡檢，所用熒光顯微鏡為OLYMPUS BX-51 (Japan)。

DAPI會(huì)在450 nm紫外激發(fā)光下發(fā)出天藍(lán)色熒光，而PI會(huì)在630 nm綠色激發(fā)光下發(fā)出亮紅色熒光。DAPI能夠透過細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，而PI無法正常通過細(xì)胞膜，只有死亡的細(xì)胞才會(huì)被PI染色，因此可聯(lián)合應(yīng)用DAPI和PI判斷賈第鞭毛蟲的活性[17]。圖2為DAPI及PI熒光顯色照片。

圖2 賈第鞭毛蟲熒光染色照片

滅活率計(jì)算公式為

滅活率=PI+(DAPI+)+(PI+) ×100% 。

式中:PI+表示PI顯色;(DAPI+)表示DAPI顯色。

2.3.2 掃描電鏡

掃描電鏡(SEM)形態(tài)學(xué)研究采用HITACHI-S4700型(Japan)，樣品用1.5 mL離心管裝取，采用2.5%戊二醛固定，然后分別用50%,75%,90%,100%乙醇多次脫水，再分別用1∶1乙醇與醋酸異戊酯溶液和純醋酸異戊酯置換，置換后的樣品用針頭挑出到疊好的稱量紙中，放入干燥器中干燥12 h，最后用離子濺射鍍膜儀噴金、檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 腐殖酸對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

腐殖酸(Humic Acid, HA)是一種水環(huán)境中常見的高分子天然有機(jī)物，其來源主要是動(dòng)植物殘?bào)w經(jīng)過一系列復(fù)雜的生物化學(xué)作用所形成的大分子有機(jī)物[18]。圖3為溫度(25±1)℃，超聲頻率19.8 kHz，功率151 W條件下，腐殖酸對(duì)US滅活賈第鞭毛蟲的影響。

圖3 腐殖酸對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖中可知，腐殖酸濃度與超聲滅活賈第鞭毛蟲的滅活率呈負(fù)相關(guān)。超聲作用10 min，腐殖酸濃度為0,1.0,2.0 mg/L時(shí)，滅活率分別為95.7%,93.8%和91.2%；腐殖酸濃度為20.0，50.0 mg/L時(shí)的滅活率分別為81.3%與80.6%。由上可知，隨著腐殖酸濃度增加，滅活率不斷下降，這可能是當(dāng)腐殖酸分子在氣相中或破碎的空化泡邊界時(shí)，很容易受到羥自由基的轟擊被氧化；而且，腐殖酸分子較容易進(jìn)入空化泡的氣相中，消耗了空化泡內(nèi)部的羥自由基，在與賈第鞭毛蟲的競(jìng)爭(zhēng)中更具優(yōu)勢(shì)[19-20]，從而導(dǎo)致滅活率下降。

3.2 濁度對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

濁度是一項(xiàng)重要的水質(zhì)指標(biāo)，天然水體由于含有大量的的懸浮物、膠體物質(zhì)、浮游生物以及微生物會(huì)引起濁度的變化。本試驗(yàn)采用溫度(25±1)℃，超聲頻率19.8 kHz，功率151 W，濁度在0～20.0 NTU范圍內(nèi)考察濁度對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響。

圖4 濁度對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖4中可以看出，當(dāng)濁度為0 NTU時(shí)，超聲10 min滅活率為95.7%。隨濁度的增加，滅活率升高，當(dāng)濁度為1.0 NTU時(shí)達(dá)到最佳滅活率(98.6%)。隨著濁度逐漸增加，滅活率不斷下降，濁度為2.0，5.0，10.0和20.0 NTU時(shí)，滅活率分別為95.2%，92.6%，90.8%和85.1%。究其原因，當(dāng)濁度較低時(shí)，溶液中的微量顆粒會(huì)導(dǎo)致空化氣泡發(fā)生不對(duì)稱潰陷，使原先的氣泡變?yōu)楦喔⑿〉臍馀?，增加了單位時(shí)間，單位體積內(nèi)空化泡的數(shù)量，即增加了空化作用的強(qiáng)度[21]。當(dāng)濁度過大時(shí)，溶液中的懸浮物質(zhì)會(huì)吸收聲波的能量，使局部聲強(qiáng)減弱導(dǎo)致空化作用降低[22]。

3.3 水中常見離子對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響

從圖5(a)中可以看出，當(dāng)超聲作用10 min后，未添加Ca2+時(shí)滅活率為95.7%，當(dāng)Ca2+濃度為1.0 mg/L時(shí)滅活率為96.3%，略高于未添加Ca2+的滅活率，其原因可能是少量的2價(jià)陽離子能夠吸附在細(xì)胞表面，并能夠打開某種“鹽橋”使細(xì)胞內(nèi)容物直接被攻擊[23]。但隨著Ca2+濃度逐漸增加滅活率下降，濃度為5.0，10.0，20.0 mg/L時(shí)，滅活率分別為92.8%，88.5%和86.2%，可見Ca2+在0～20.0 mg/L范圍內(nèi)對(duì)滅活的影響并不明顯。

圖5(b)為Zn2+對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲的影響。Zn2+濃度0～20.0 mg/L并未明顯地促進(jìn)或抑制賈第鞭毛蟲滅活率。從圖5(b)中可看出，當(dāng)超聲作用10 min后，其中Zn2+為0 mg/L，滅活率為95.7%，當(dāng)Zn2+濃度增加，分別為1.0,5.0,10.0,20.0 mg/L，滅活率為93.8%,92.5%,91.4%和90.9%。

3.4 超聲滅活賈第鞭毛蟲機(jī)制探討

圖6為超聲(151 W，19.8 kHz)作用前后賈第鞭毛蟲的掃描電鏡(SEM)照片，其中圖6(a)為超聲之前的SEM照片，圖6(b)、圖6(c)分別為超聲后的賈第鞭毛蟲SEM照片。對(duì)比3張照片可以看到，未進(jìn)行超聲作用，賈第鞭毛蟲形態(tài)較為完整，經(jīng)過10 min超聲之后照片中難以找到完整的；對(duì)比圖6中的(a)，(b)可以明顯看出，在超聲前賈第鞭毛蟲具有完整的橢圓結(jié)構(gòu)，經(jīng)過超聲后細(xì)胞扭曲、變形，形態(tài)不再完整；經(jīng)過10 min超聲作用(圖6(c))，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全破壞；也可以說明超聲滅活賈第鞭毛蟲主要是超聲破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致賈第鞭毛蟲失去活性。研究認(rèn)為，超聲的空化作用所產(chǎn)生的高速微射流的機(jī)械剪切作用是導(dǎo)致微生物失活的主要作用，超聲可以完全破壞了大腸桿菌和酵母菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)[25-26]。而本文的掃描電鏡結(jié)果說明：超聲空化所產(chǎn)生的自由基氧化作用和超聲過程中空化泡破裂所產(chǎn)生的高速微射流的機(jī)械剪切作用均是導(dǎo)致賈第鞭毛蟲死亡的主要原因。

圖6 超聲作用賈第鞭毛蟲前后掃描電鏡照片

4 結(jié) 論

(1) 腐殖酸濃度與超聲滅活賈第鞭毛蟲的滅活率呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)腐殖酸濃度達(dá)到20.0 mg/L后，腐殖酸濃度對(duì)滅活率影響不大。

(2) 濁度對(duì)超聲滅活賈第鞭毛蟲影響較為顯著，呈低濃度促進(jìn)，高濃度抑制趨勢(shì)，濁度在1.0 NTU時(shí)達(dá)到98.6%，隨著濁度增加滅活率逐漸下降，原因是濁度較低時(shí)能增加空化作用的強(qiáng)度，濁度較高會(huì)吸收聲波能量。

(4) 掃描電鏡(SEM)進(jìn)行的形態(tài)學(xué)觀察可見，經(jīng)過10 min的超聲之后，視野中難以找到完整的賈第鞭毛蟲細(xì)胞，表明超聲的空化作用是導(dǎo)致賈第鞭毛蟲失活的主要原因。

參考文獻(xiàn)：

[1] CUI F Y, ZUO J L, ZHAO Z W,etal.Review of Giardia and Cryptosporidium in Drinking Water[J].Harbin Institute Technology, 2006, 38(9): 1487-1491.

[2] BALDURSSON S, KARANIS P.Waterborne Transmission of Protozoan Parasites: Review of Worldwide Outbreaks-An Update 2004-2010[J].Water Research, 2011, 45(20): 6603-6614.

[3] 鄧明俊, 肖西志.藍(lán)氏賈第鞭毛蟲檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2012, 33(12): 168-173.(DENG Ming-jun, XIAO Xi-zhi.Progress on Detection Methods for Giardia lamblia[J].Progress in Veterinary Medicine, 2012, 33(12): 168-173.(in Chinese))

[4] GB 5749—2006，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2006.(GB 5749—2006, Standard of Drinking Water[S].Beijing: Chinese Standard Press, 2006.(in Chinese))

[5] WICKRAMANAYAKE G B, ALAN J R, SPROUL O J.Inactivation ofGiardialambliacystswith Ozone[J].Applied and Environmental Microbiology, 1984, 48(3): 671-672.

[6] EUGENE W R, JOHN C H.Inactivation ofGiardiacystsby Ultraviolet Irradiation[J].Applied and Environmental Microbiology, 1981, 42(3): 546-547.

[7] HAYES S L, RICE E W, WARE M W,etal.Low Pressure Ultraviolet Studies for Inactivation ofGiardiamuriscysts[J].Journal of Applied Microbiology, 2003, 94(1): 54-59.

[8] 李金玉，冉治霖.H2O2/O3協(xié)同滅活水中隱孢子蟲影響因素研究[J].長江科學(xué)院院報(bào),2013, 30(9): 17-21.(LI Jin-yu, RAN Zhi-lin.Synergistic Effect of H2O2/O3on the Inactivation ofCryptosporidiumparvumin Water[J].Journal of Yangtze River Scientific Research Institute， 2013, 30(9): 17-21.(in Chinese))

[9] MONTEMAYOR M, GALOFRE B, RIBAS F,etal.Comparative Study between Two Laser Scanning Cytometers and Epifluorescence Microscopy for the Detection of Cryptosporidium oocysts in Water [J].Cytometry Part A, 2007,71(3):163-169.

[10] 王 琳, 王寶貞.飲用水深度處理技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2001: 276-338.(WANG Lin, WANG Bao-zhen.Advanced Treatment of Drinking Water[M].Beijing: Chemical Industry Press, 2001: 276-338.(in Chinese))

[11] HUA I, THOMPSON J E.Inactivation ofEscherichiacoliby Sonication at Discrete Ultrasonic Frequencies[J].Water Research, 2002, 34(10): 3888-3893.

[12] 靳慧霞, 董 濱, 孫 穎, 等.超聲協(xié)同紫外滅活大腸桿菌試驗(yàn)研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33(11)：22-27.(JIN Hui-xia, DONG Bin, SUN Ying,etal.Synergistic Efficiency of E.Coli Inactivation under US and UV[J].Environmental Science & Technology, 2010，33(11)：22-27.(in Chinese))

[13] 閆 坤, 呂加平, 劉 鷺, 等.超聲波對(duì)液態(tài)奶中枯草芽孢桿菌的殺菌作用[J].中國乳品工業(yè), 2010, 38(2): 4-6.(YAN Kun，LV Jia-ping，LIU Lu,etal.Sterilization of Ultrasound on liquid milk in Bacillus subtilis[J].China Dairy Industry, 2010, 38(2): 4-6.(in Chinese))

[14] 李紹峰, 冉治霖, 高云霞, 等.隱孢子蟲3種檢測(cè)方法比較[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào), 2009, 3(1): 47-51.(LI Shao-feng, RAN Zhi-lin, GAO Yun-xia,etal.Comparison of Three Methods for Detection of Cryptosporidium[J].Chinese Journal of Environmental Engineering, 2009, 3(1): 47-51.(in Chinese))

[15] 冉治霖, 李紹峰, 朱 靜, 等.二氧化氯滅活水中隱孢子蟲的影響因素及機(jī)理研究[J].中國環(huán)境科學(xué), 2011, 31(6): 904-909.(RAN Zhi-lin, LI Shao-feng, ZHU Jing,etal.CryptosporidiumInactivated by Chlorine Dioxide in Water and Disinfect Mechanisms[J].China Environmental Science, 2011, 31(6): 904-909.(in Chinese))

[16] 冉治霖, 李紹峰, 黃君禮, 等.氯氣滅活飲用水中隱孢子蟲的影響因素[J].中國環(huán)境科學(xué), 2011, 30(6): 786-790.(RAN Zhi-lin, LI Shao-feng, HUANG Jun-li,etal.Effect of Various Factors on Chlorine Inactivating Cryptosporidium in Water[J].China Environmental Science, 2011, 30(6): 786-790.(in Chinese))

[17] 胡健龍, 冉治霖, 李紹峰, 等.超聲滅活飲用水中隱孢子蟲研究[J].中國環(huán)境科學(xué), 2014, 34(3): 431-436.(HU Jian-long, RAN Zhi-lin, LI Shao-feng,etal.Inactivation ofCryptosporidiumParvumin Drinking Water by Ultrasonic Irradiation[J].China Environmental Science, 2014, 34(3): 431-436.(in Chinese))

[18] HAYAKAWA M, NONOMURA H.Humic Acid-vitamin Agar, a New Medium for the Selective Isolation of Soil Actinomycetes[J].Journal of Fermentation Technology, 1987, 65(5): 501-509.

[19] HOIGNé J, BADER H.Rate Constants of Reactions of Ozone with Organic and Inorganic Compounds in Water Ⅲ: Inorganic Compounds and Radicals [J].Water Research, 1985, 19(8): 993-1004.

[20] NADDEO V, BELGIORNO V, NAPOLI R M A.Behaviour of Natural Organic Matter During Ultrasonic Irradiation[J].Desalination, 2007, 210(1/3):175.

[21] SRAVAN K S, SHYAM S P, GOGATE P R,etal．Characterization of Sonochemical Reactor for Physicochemical Transformations[J].Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48(21): 9402-9407.

[22] TORU T, KYUICHI Y, MANICKAM S,etal.Correlation between Acoustic Cavitation Noise and Yield Enhancement of Sonochemical Reaction by Particle Addition[J].Journal of Physical Chemistry A, 2005, 109(21) : 4869-4872.

[23] JASON W R, JACK S, GELI G,etal.Calcium Efflux is Essential for Bacterial Survival in the Eukaryotic Host[J].Molecular Microbiology， 2008, 70(2): 435-444.

[24] GOEL M, HONGQIANG H, MUJUMDAR A S,etal.Sonochemical Decomposition of Volatile and Non-volatile Organic Compounds：A Comparative Study[J].Water Research, 2004, 38:4247-4261.

[25] IKUKO O, TOMO T, YASUNORI O,etal.Comparison between the Effects of Ultrasound and γ-rays on the Inactivation ofSaccharomycescerevisiae: Analyses of Cell Membrane Permeability and DNA or RNA Synthesis by Flow Cytometry[J].Ultrasonics Sonochemistry,2009,16:532-536.

[26] CUI X, JEFFREY T W, LIU G,etal.Effects of Primary Sludge Particulate(PSP) Entrapment on Ultrasonic(20kHz) Disinfection of Escherichia Coli[J].Water Research, 2011,45(11): 3300-3308.