， ， ，,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100)

左乙拉西坦(Levetiracetam,LEV)，化學(xué)名(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，是作用機(jī)制獨(dú)特的新型抗癲癇類藥物[1-2]，目前主要通過化學(xué)法制備[3].隨著LEV市場需求的增加，越來越多該藥物的合成方法被報(bào)道[4-5].利用生物法制備手性藥物及其手性中間體因具有立體選擇性高，專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好等特點(diǎn)而逐漸成為研究熱點(diǎn)[6-8].以生物催化法合成LEV或LEV手性羧酸中間體可彌補(bǔ)化學(xué)法存在的不足，為研究者提供了新的思路[9].Tao等報(bào)道了通過半理性設(shè)計(jì)(semi-rational design)獲得腈水合酶突變體，用于催化外消旋(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙腈不對稱合成LEV，產(chǎn)率和ee值分別為43%和94%[10]，但(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙腈的合成過程中需使用高毒性的2-氯丁腈作為原料.

耐酪氨酸冢村氏菌E105菌株系本課題組從土壤中篩選得到.該菌株可選擇性催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯不對稱水解制備(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸，該手性羧酸經(jīng)酰胺化后即可制得LEV.筆者所在課題組前期研究中通過對培養(yǎng)基成分篩選和反應(yīng)條件優(yōu)化，在10 mL反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)了(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分，產(chǎn)率和ee值分別達(dá)45%和99%[11-12].為進(jìn)一步提高該菌株的催化能力，有必要對其產(chǎn)酶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而提高其應(yīng)用潛力，進(jìn)而為LEV的規(guī)?；苽涮峁┮罁?jù).響應(yīng)面法可通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合建模，分析評價(jià)多因素間的交互作用，并預(yù)測最優(yōu)結(jié)果，是適合對多變量體系進(jìn)行評價(jià)和優(yōu)化的快捷有效方法，近年來已有一些通過響應(yīng)面法對生物反應(yīng)過程進(jìn)行優(yōu)化的報(bào)道[13-15].本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得到E105細(xì)胞產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的最優(yōu)條件，繼而，利用其靜息細(xì)胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分制備左乙拉西坦關(guān)鍵手性中間體(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸.

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

耐酪氨酸冢村氏菌E105，本課題組從土壤中篩選，并保藏.

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0.

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15 g/L，NH4Cl 9.5 g/L，酵母膏12.1 g/L，K2HPO42 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.6 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0.

1.2 分析方法與酶活力測定

生物拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的反應(yīng)過程：

α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸產(chǎn)率及ee值參照本課題組報(bào)道的HPLC和GC法測定[11,16].

α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸產(chǎn)率為

產(chǎn)率=Cp/Cs×100%

式中：Cp表示產(chǎn)物α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的濃度；Cs表示底物(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的濃度.

(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸的光學(xué)純度通過對映體過量值(enantiomeric excess,ee)表征為

t1為煙氣在第1區(qū)域停留時間（s）；t2為煙氣在第2區(qū)域停留時間（s）；t3為煙氣在第3區(qū)域停留時間（s）；t4為煙氣在第4區(qū)域停留時間（s）；v1為煙氣在第1區(qū)域平均速度（m/s）；v2為煙氣在第2區(qū)域平均速度（m/s）；v3為煙氣在第3區(qū)域平均速度（m/s）；v4為煙氣在第4區(qū)域平均速度（m/s）。

ee=(AS-AR)/(AS+AR)×100%

式中：AS為S型產(chǎn)物峰面積；AR為R型產(chǎn)物峰面積.

酶活力定義：30 ℃下，每分鐘生成1 μmol(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸所需的酶量定義為一個酶活力單位(U).

酶活力測定：稱取0.3 g(DCW)菌體，重懸于10 mL磷酸鉀緩沖液中，加入30 mmol/L的(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯，30 ℃，200 r/min反應(yīng)1 h，9 000 r/min離心10 min，除去菌體以終止反應(yīng)，取上清液檢測(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量，計(jì)算得到單位重量的菌體酶活力(U/g).

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用初始發(fā)酵培養(yǎng)基配方，考察不同裝液量(150～350 mL/L)，接種量(2%～6%)和培養(yǎng)時間(24～48 h)對菌體產(chǎn)酶的影響，確定E105菌株最佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)條件.

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案，考察發(fā)酵培養(yǎng)基組成對產(chǎn)酶的影響.

1.4.1 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)

對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖(A)，酵母膏(B)，氯化銨(C)，磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀(D)，pH(E)，硫酸銨(F)，氯化鈉(G)7個因素和2個虛擬變量(H,I)，進(jìn)行N=12的9因素PB實(shí)驗(yàn)，篩選出對產(chǎn)酶影響顯著的因素.

1.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

1.4.3 Box-Behnken(BB)實(shí)驗(yàn)

對由PB實(shí)驗(yàn)確定的顯著因子和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的中心點(diǎn)，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，設(shè)計(jì)N=17的3因素3水平實(shí)驗(yàn)，其中5個為零點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn).

1.5 (R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分

(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分反應(yīng)在500 mL搖瓶中進(jìn)行.將培養(yǎng)獲得的E105菌體重懸于磷酸鉀緩沖液中，搖瓶裝液量為300 mL，菌體添加量為30 g/L(DCW)，加入不同濃度的(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯(40～90 mmol/L)，30 ℃，200 r/min反應(yīng)32 h，以考察不同底物濃度對生物拆分的影響.通過測定產(chǎn)物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸濃度、產(chǎn)率和ee值，確定拆分反應(yīng)的最佳底物濃度，并考察在該底物濃度下的生物拆分過程曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)條件單因素實(shí)驗(yàn)考察

分別考察了裝液量，接種量和培養(yǎng)時間對菌體產(chǎn)酶的影響.如圖1所示，當(dāng)搖瓶裝液量為300 mL/L，接種量為4%，培養(yǎng)時間為36 h時，酶活力分別達(dá)到最大值.當(dāng)培養(yǎng)時間超過36 h后，菌體增長速度開始減緩，菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期.

2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

按照Design Expert 8.0.6軟件的設(shè)計(jì)，對初始發(fā)酵培養(yǎng)基中7個因素(葡萄糖，酵母膏，氯化銨，磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀，pH，硫酸銨，氯化鈉)和2個虛擬變量進(jìn)行N=12的9因素PB實(shí)驗(yàn)(表1)，以篩選出對產(chǎn)酶影響顯著的因素.由表2可知：A,B,E三因素的P值均小于0.05，是影響菌體產(chǎn)酶的顯著因子.因此，選取葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度，以及培養(yǎng)基初始pH值三因素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

圖1 培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素、水平和結(jié)果分析

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度，及培養(yǎng)基初始pH進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，3因素的步長選擇分別為2.5 g，3 g和0.5，并同步逐漸增大，尋找最優(yōu)區(qū)域.表3結(jié)果表明：第3組實(shí)驗(yàn)的酶活力最高，為19.03 U/g，表明此時3個變量的取值已經(jīng)接近最優(yōu)點(diǎn)附近區(qū)域.因此，選擇這一組數(shù)據(jù)作為中心點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化.

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)

如表4所示，以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的中心點(diǎn)，根據(jù)Box-Behnken中心組合原理，設(shè)計(jì)N=17的3因素3水平實(shí)驗(yàn)，其中5個為零點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用Design-Expert 8.0.6對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到如下的擬合方程模型：

Y=19.1+0.45X1+0.64X2+0.95X3-0.28X1X2-

0.47X1X3-0.48X2X3-2.71X12-2.07X22-

0.68X32

表5對模型回歸系數(shù)顯著性的檢驗(yàn)表明：該模型中每個因子對Y值的影響均高度顯著，表明葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度與培養(yǎng)基初始pH值三者之間存在明顯的交互作用.對該模型進(jìn)行方差分析，模型P<0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.201 6，R2=0.994 5，表明該模型高度顯著，擬合度良好，能夠用于預(yù)測.由圖2可知：當(dāng)pH取值為中心點(diǎn)7.0時，酶活力最大值出現(xiàn)在曲面的中央?yún)^(qū)域，表明葡萄糖和酵母膏的質(zhì)量濃度過高或過低，都會影響菌體產(chǎn)酶；而當(dāng)葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度分別位于中心點(diǎn)17.5 g/L和16.0 g/L時，適當(dāng)提高培養(yǎng)基的初始pH值，有利于產(chǎn)酶.

表4 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表5 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

圖2 各因素對菌體產(chǎn)酶的交互影響影響曲面圖

2.5 最優(yōu)條件的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

根據(jù)擬合方程，可求得當(dāng)Y為最大值19.41 U/g時，對應(yīng)的X1，X2，X3編碼值分別為0.079，0.177，0.642.轉(zhuǎn)換為實(shí)際值可得到預(yù)測結(jié)果：葡萄糖17.70 g/L，酵母膏16.53 g/L，pH 7.32.經(jīng)3次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)際酶活力為19.33 U/g，較優(yōu)化前的14.58 U/g提高了32.6%，且實(shí)際值接近理論預(yù)測值，表明該模型可較好預(yù)測E105菌體的實(shí)際發(fā)酵情況.同時，在最優(yōu)產(chǎn)酶條件下，E105菌體細(xì)胞干重為4.13 g/L，較優(yōu)化前提高了60.1%.

2.6 (R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的生物拆分

底物濃度是影響生物拆分反應(yīng)的重要因素之一.為考察經(jīng)產(chǎn)酶條件優(yōu)化后制備得到的E105細(xì)胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯不對稱水解反應(yīng)的最佳底物濃度，實(shí)驗(yàn)選取40～90 mmol/L的底物濃度進(jìn)行生物拆分，反應(yīng)介質(zhì)為300 mL磷酸鉀緩沖液，細(xì)胞加量為30 g/L(DCW)，30 ℃，200 r/min反應(yīng)32 h.由圖3可知：當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸產(chǎn)率達(dá)48.5%，ee值為99%.繼續(xù)提高反應(yīng)的底物濃度，產(chǎn)率逐漸降低.與產(chǎn)酶條件優(yōu)化前相比，E105細(xì)胞催化拆分的底物濃度可提高至60 mmol/L，較優(yōu)化前提高了20%，且底物濃度的增加對ee值影響較小.

圖3 底物濃度對E105細(xì)胞催化生物拆分反應(yīng)的影響

底物濃度為60 mmol/L時的生物拆分反應(yīng)過程曲線如圖4所示.結(jié)果表明：反應(yīng)24 h后，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸產(chǎn)率和ee值分別達(dá)到48%和99%，最佳拆分反應(yīng)時間以24 h為宜.

圖4 耐酪氨酸冢村氏菌E105細(xì)胞生物拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的過程曲線

圖5為產(chǎn)酶條件優(yōu)化前后制備得到的E105細(xì)胞催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯生物拆分反應(yīng)結(jié)果的比較.結(jié)果表明：在優(yōu)化的產(chǎn)酶條件下制備得到的含酶細(xì)胞催化拆分24 h后，產(chǎn)物(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量為8.64 mmol，終濃度達(dá)28.8 mmol/L，較優(yōu)化前提高了32.1%.

圖5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化前后制備得到的E105細(xì)胞催化生物拆分反應(yīng)結(jié)果的比較

3 結(jié) 論

對耐酪氨酸冢村氏菌E105菌株產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化.基于響應(yīng)面分析，建立了葡萄糖和酵母膏質(zhì)量濃度，培養(yǎng)基初始pH值三因素對產(chǎn)酶影響的數(shù)學(xué)模型.經(jīng)方差分析表明：該模型高度顯著，擬合度良好.在優(yōu)化的產(chǎn)酶條件下，E105菌體的酶活力為19.33 U/g，細(xì)胞干重達(dá)4.13 g/L，分別較優(yōu)化前提高了32.6%和60.1%.將培養(yǎng)得到的E105靜息細(xì)胞用于催化(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸乙酯的不對稱水解，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時，反應(yīng)24 h，(S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸生成量為8.64 mmol，產(chǎn)率和ee值分別為48%和99%，產(chǎn)物終濃度為28.8 mmol/L，較優(yōu)化前提高了32.1%，有效提高了耐酪氨酸冢村氏菌E105催化生物拆分反應(yīng)的效率，為后續(xù)研究奠定了較好的基礎(chǔ).

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