張志鷹,張志民,閆勝男，翟利云

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 牙體牙髓病科，長(zhǎng)春130021)

牙髓炎是人體常見(jiàn)的口腔疾病，是由于細(xì)菌(主要為G-菌)入侵牙本質(zhì)包繞的牙髓而引起的一種炎癥反應(yīng)[1]。趨化因子是一類指導(dǎo)白細(xì)胞移行到炎癥感染部位，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)的一類低分子量的(多為8-10 kD)分泌蛋白，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用[2]。CCL20，CC亞族趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20)，依據(jù)2000年公布的新的命名法則命名[3]，曾稱巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-3α，由1997年被Rossi等首次利用生物學(xué)技術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)。CCL20是趨化因子CC家族中的重要一員，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，CCL20是一類對(duì)多種細(xì)胞如未成熟DC、單核細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞具有明顯趨化作用的細(xì)胞因子，對(duì)人體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)都有密切的關(guān)系，其唯一的受體是趨化因子受體6(chemokine receptor6,CCR6)[4,5]。在炎癥疾病中，CCL20的主要功能是趨化未成熟的效應(yīng)T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，對(duì)球菌和G-桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，是一種天然的抗菌蛋白。目前，已有學(xué)者研究了CCL20及其受體CCR6的表達(dá)變化在乳腺癌、宮頸病變、牛皮癬發(fā)病機(jī)制中的作用[6-8]，以及其在支氣管哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制[9]。牙髓疾病一般是由細(xì)菌侵襲牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，引起牙髓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，與體內(nèi)其它部位相似，目前，并無(wú)CCL20與牙髓炎癥疾病相關(guān)的報(bào)道，其在牙髓疾病中的發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)理也尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)法，檢測(cè)人體正常、慢性及急性炎癥中CCL20在牙髓組織中的表達(dá)，初步揭示CCL20是否參與牙髓炎癥的應(yīng)答反應(yīng)，為進(jìn)一步探討CCL20在牙髓損傷修復(fù)中的具體調(diào)控作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本與主要試劑

實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本來(lái)源由吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院2013年2月-10月接受口腔牙體牙髓科及口腔正畸科治療的患者自愿提供。急性牙髓炎組(AP)，慢性牙髓炎組(CP)，正常牙髓組(NS)各20例(正畸科取無(wú)齲壞，無(wú)牙周病，無(wú)牙髓炎癥的正常牙)，患者年齡16-65歲之間。所用標(biāo)本全部選用無(wú)關(guān)節(jié)炎病史及全身系統(tǒng)性疾病史，并且為兩個(gè)月內(nèi)未服用免疫抑制劑及抗菌藥物，之前未做過(guò)牙髓治療的標(biāo)本。1抗：Rabbit Anti-CCl20 antibody(bs-1268R) ；2抗：SP Kit(Broad Spectrum) (SP-0022)；DAB顯色劑；PBS；檸檬酸修復(fù)液；抗體稀釋液

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牙髓組織切片 取臨床上慢性，急性牙髓炎及正畸患者的牙髓組織，拔出后立即置入40 g/L多聚甲醛中，4℃恒溫固定24 h后，根據(jù)不同的牙髓組織癥狀，分為3組(急性炎癥組，慢性炎癥組，正常對(duì)照組),每組20例，再次恒溫4℃固定，固定時(shí)間為24 h，牙髓組織常規(guī)脫水后石蠟包埋，做成5 μm厚度的切片。將3組標(biāo)本共60例逐個(gè)進(jìn)行HE染色后免疫組化染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察。使用HE染色結(jié)果來(lái)當(dāng)作病理學(xué)分組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)而區(qū)分個(gè)組標(biāo)本。

1.2.2 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫水至水化，PBS沖洗5 min,3次，高溫修復(fù)抗原(沸水浴修復(fù)15 min，自然涼至室溫，PBS沖洗5 min,3次，正常山羊血清封閉，37℃20 min，一抗孵育(比例1∶100)，4℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記的第二抗體(羊抗兔IgG)37℃20 min，辣根酶標(biāo)記的鏈酶親和素(三抗)，37℃20 min,DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明后中性樹(shù)膠封片，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察人炎癥牙髓組織中CCL20的表達(dá)

1.2.3 結(jié)果判定 陽(yáng)性細(xì)胞的判定特征：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)黃色，可見(jiàn)棕黃色染色顆粒。陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)算方法：在400倍光學(xué)顯微鏡下，從每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取4個(gè)視野，查取各個(gè)視野下CCL20陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)查取整個(gè)視野細(xì)胞總數(shù)，按照公式：陽(yáng)性細(xì)胞%=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%計(jì)算各個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞比例，求4個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均值，即為陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0做方差分析，通過(guò)Q檢驗(yàn)比較每?jī)山M間CCL20陽(yáng)性細(xì)胞率的差異性，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下所見(jiàn)

2.1.1 健康牙髓組 鏡下可見(jiàn)大量的組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，散在T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞，未見(jiàn)B細(xì)胞。其中T細(xì)胞主要分布在牙髓邊緣區(qū)域。T細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)未見(jiàn)黃染，無(wú)棕黃色顆粒，即CCL20無(wú)表達(dá)(如圖1)。

2.1.2 炎癥牙髓組 不用牙髓標(biāo)本及同一切片的不同區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞密度明顯不同。鏡下可見(jiàn)慢性牙髓炎組黃染程度明顯強(qiáng)于急性牙髓炎組(如圖2、3)。

鏡下可見(jiàn)炎癥牙髓中有大量T細(xì)胞、B細(xì)胞浸潤(rùn)，樹(shù)突狀細(xì)胞增加并聚集。炎癥細(xì)胞主要分布于病變區(qū)域，其中急性組中T細(xì)胞浸潤(rùn)少于慢性組，兩組之間B細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)明顯差異。在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域可見(jiàn)B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的黃染，其中細(xì)胞質(zhì)染色較淺同時(shí)可見(jiàn)棕黃色顆粒(如圖4、5、6)。

圖1健康牙髓組，×200圖2炎癥牙髓組(慢性)，×200圖3炎癥牙髓組(急性)，×200

圖4CCL20在炎癥牙髓樹(shù)突狀細(xì)胞中的表達(dá)，×200圖5CCL20在炎癥牙髓T細(xì)胞中的表達(dá)，×200圖6CCL20在炎癥牙髓B細(xì)胞中的表達(dá)，×200

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

CCL20的陽(yáng)性細(xì)胞率統(tǒng)計(jì)分析如表1所示， 3組標(biāo)本CCL20的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率有顯著性差異(P<0.05)。

表1 各組牙髓標(biāo)本中CCL20陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率(%)

3 討論

CCL20屬趨化因子CC亞族，相對(duì)分子質(zhì)量為9000[10]，基因定位于2q35-36，包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子[11-13]。CCL20可在不同因素刺激下由多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，包括成纖維細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、記憶T細(xì)胞，及某些腫瘤細(xì)胞[14]。CCR6為CCL20的唯一受體，可與CCL20特異性結(jié)合，主要表達(dá)于記憶T細(xì)胞、未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞。CCL20的生物學(xué)特性復(fù)雜，主要包括以下幾個(gè)方面：①CCL20與其受體CCR6相互作用控制B細(xì)胞的分化、發(fā)育。趨化未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞向炎癥部位遷移，活化單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞；②增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)其與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附；③趨化B細(xì)胞，并刺激活化B細(xì)胞產(chǎn)生多種免疫球蛋白等。

牙髓組織炎癥是由宿主對(duì)病原體發(fā)生的免疫反應(yīng)造成的，包括非特異性炎癥反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。當(dāng)牙髓組織即便是牙本質(zhì)小管中，受到病原體如變形鏈球菌、革蘭陰性厭氧菌、普沃雷菌等入侵時(shí)都會(huì)發(fā)生炎性變化。炎性變化的組織部位有大量的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞存在，炎性變化部位的局部還存在一些免疫球蛋白，主要為IgG。牙髓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，既有多種免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE、IgM等存在，又有淋巴細(xì)胞、多種T細(xì)胞及其介質(zhì)參與的免疫反應(yīng)存在，所以體液免疫和細(xì)胞免疫在牙髓組織炎癥過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)首次檢測(cè)人體炎癥牙髓組織中CCL20的表達(dá)。結(jié)果顯示，CCL20主要在牙髓組織細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞膜、細(xì)胞核多不表達(dá)。并且在人體炎癥牙髓組織中CCL20 表達(dá)較高，而正常牙髓組織CCL20基本不表達(dá)，當(dāng)牙髓組織受到細(xì)菌、致炎因子、細(xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物等侵襲時(shí)，CCL20的表達(dá)明顯增加，說(shuō)明CCL20參與了牙髓炎癥反應(yīng)，當(dāng)人體牙髓組織自身的防御能力過(guò)弱或者病原體的刺激過(guò)強(qiáng)時(shí)，在病原體的不斷刺激下，中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、活化T細(xì)胞等細(xì)胞會(huì)分泌多種炎癥細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，也會(huì)增加CCL20在組織中的表達(dá)，而趨化因子CCL20的上調(diào)表達(dá)又會(huì)活化并趨化樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等細(xì)胞向病損部位遷移，并刺激B細(xì)胞產(chǎn)生多種免疫球蛋白如IgG、IgA、IgE等,在此防御過(guò)程中，不可避免地會(huì)造成組織的損傷與破壞。由此推測(cè)趨化因子CCL20在牙髓組織炎癥狀態(tài)下可能具有致炎作用，CCL20通過(guò)上調(diào)表達(dá)調(diào)動(dòng)了機(jī)體的炎癥免疫應(yīng)答水平。

綜上可以確定，牙髓組織炎癥反應(yīng)與CCL20的表達(dá)存在一定的相關(guān)性，由于趨化因子CCL20以及其受體CCR6作用網(wǎng)絡(luò)及在炎癥時(shí)牙髓組織免疫反應(yīng)機(jī)制的復(fù)雜性，CCL20在牙髓組織免疫應(yīng)答時(shí)具體的調(diào)控作用以及與其他牙髓組織中的趨化因子、制炎因子的相關(guān)聯(lián)系還有待深入的研究。

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