★ 唐才林 高言明 楊春 林昌虎 吳明花 徐東升

(1.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550002；2.貴州理工學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550003；3.貴州科學(xué)院 貴州 貴陽(yáng) 550001)

中國(guó)藥典2010版上還未收載采用有效成分含量作為中藥鉤藤質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[1]，鉤藤藥材的采收期是根據(jù)民間習(xí)慣于秋、冬二季采收。鉤藤在臨床上主要用于降壓，其藥效成分主要為生物堿類，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察不同采收期毛鉤藤中總生物堿與多糖含量的變化情況來(lái)研究毛鉤藤的最佳采收期具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 儀器與試藥

紫外-可見分光光度計(jì)(島津UV-2501PC)；AE-240雙量程電子分析天平(梅特勒-托利多上海有限公司)；pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。異鉤藤堿對(duì)照品(批號(hào)：111927-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；醋酸，醋酸鈉，溴甲酚綠，葡萄糖，氨水，三氯甲烷等均為分析純，水為蒸餾水。藥材樣品采自貴州省開陽(yáng)縣翁昭村毛鉤藤種植基地人工種植五年生毛鉤藤，采樣于2012年1月～2012年12月，按每月1～10號(hào)之內(nèi)在同一毛鉤藤種植區(qū)域中采取帶鉤老莖枝作為樣品，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院付志明鑒定為茜草科植物毛鉤藤(UncariahirsuteHavil)，藥材樣品在室內(nèi)陰干經(jīng)粉碎后于45℃烘至恒重并置于干燥器中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 毛鉤藤總生物堿含量分析[2]

2.1.1 溶液的制備

2.1.1.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備 取異鉤藤堿對(duì)照品10.30mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為103.00μg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取鉤藤樣品粉末約0.16g，置于50mL具塞的錐形瓶中，加入1%鹽酸甲醇10mL，放入4℃冰箱中冷浸12h后取出，室溫超聲45min，濾過(guò)，再加入1%鹽酸甲醇10mL，室溫超聲45min，濾過(guò)，合并濾液于蒸發(fā)皿中，置60℃水浴中揮干濾液，殘?jiān)?0mL稀氨水溶解，使溶液呈堿性，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，將合并的氯仿層于蒸發(fā)皿中60℃水浴揮干，殘?jiān)觩H=3.4的緩沖液和酸性染料各5mL，溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，精密加入10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，合并氯仿層溶液，即為顯色后的供試品溶液。

2.1.1.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的制備 配制0.2mol/L的醋酸鈉溶液250mL，0.2mol/L的醋酸溶液500mL，備用，使用之前按醋酸鈉溶液約0.88mL與醋酸溶液約24.12mL混勻，用pH計(jì)精密調(diào)至pH=3.4。

2.1.1.3 溴甲酚綠酸性染料溶液的制備 稱取溴甲酚綠0.25g，加0.05mol/L的氫氧化鈉溶液5mL研磨，再加水配成500mL，用三氯甲烷洗棄脂溶性雜質(zhì)至三氯甲烷層不顯色，儲(chǔ)存于500mL容量瓶中備用。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別用按2.1.1.1項(xiàng)制備并顯色后的供試品和對(duì)照品溶液，同法制備空白溶液，在紫外-可見分光光度計(jì)300～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得最大吸收波長(zhǎng)為410nm。

2.1.3 顯色條件的選擇

2.1.3.1 緩沖液pH值的選擇 由于在顯色體系中pH值對(duì)顯色效果影響最大，因此首先配制pH值分別為3.1，3.4，3.6，3.8，4.0，4.2，4.4的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。精密量取6份異鉤藤堿對(duì)照品溶液各5mL于蒸發(fā)皿中，60℃水浴上揮干溶劑后分別用以上緩沖溶液各5mL和5mL溴甲酚綠酸性染料溶解殘?jiān)?轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，再精密加入10mL氯仿，充分振搖萃取3min，靜置分層，收集氯仿層，反復(fù)萃取3次，合并氯仿層溶液，同法制備7個(gè)相應(yīng)pH值的空白溶液，于紫外-可見分光光度計(jì)410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示緩沖溶液pH為3.4時(shí)吸光度最大，故選擇之。

表1 緩沖溶液不同pH值試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3.2 溴甲酚綠溶液用量的選擇 精密吸取對(duì)照品溶液共5份，每份2mL，于蒸發(fā)皿中在60℃水浴鍋上緩慢蒸干，分別加入pH為3.4的緩沖溶液5mL和不同體積的溴甲酚綠酸性染料溶解殘?jiān)?，?.1.3.1項(xiàng)“轉(zhuǎn)移至分液漏斗中”同法操作，并同法制備5個(gè)相應(yīng)溴甲酚綠酸性染料用量的空白溶液在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果見表2，可知溴甲酚綠酸性染料用量為5mL時(shí)較為適宜。

表2 溴甲酚氯染料用量選擇試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為103.00μg/mL的異鉤藤堿對(duì)照品2.0，4.0，5.0，7.0，9.0mL于5個(gè)10mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述各濃度的對(duì)照品溶液5mL于蒸發(fā)皿中60℃水浴上揮干，殘?jiān)?.1.1.1項(xiàng)下“殘?jiān)觩H=3.4的緩沖液和酸性染料各5mL”起同法操作，以相應(yīng)試劑為空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在410nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸計(jì)算，得總生物堿的回歸方程為：Y=0.053X+0.0422，r=0.9997。結(jié)果表明總生物堿在3.43～15.45μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取按上述方法制備的對(duì)照品溶液5mL，顯色后，分別測(cè)定6次吸光度，計(jì)算RSD為2.41%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按“2.1.1.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3h進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算RSD為1.38%，表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取3月份采收的毛鉤藤樣品粉末6份，每份約0.16g，分別置于6個(gè)50mL具塞錐形瓶中，按“2.1.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在410nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出該鉤藤藥材的總生物堿(以異鉤藤堿計(jì))的平均含量為0.17%，RSD為1.81%。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知總生物堿平均含量為0.17%的毛鉤藤樣品粉末6份，每份約0.08g，分別置6個(gè)50mL具塞錐形瓶中，每份分別精密加入濃度為144.00μg/mL的異鉤藤堿對(duì)照品1mL，按“2.1.1.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在410nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算得平均回收率為100.78%，RSD%為2.81。

2.1.9 樣品含量測(cè)定 按2.1.1.1項(xiàng)下制備方法，對(duì)各毛鉤藤樣品進(jìn)行供試溶液制備，每份樣平行3份，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在410nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出總生物堿(以異鉤藤堿計(jì))的含量，結(jié)果見表1。

2.2 毛鉤藤多糖含量分析[3]

2.2.1 對(duì)照品溶液和供試品溶液的制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖0.0903g，精密稱定，置100mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為903.00μg/mL的對(duì)照品溶液。取毛鉤藤樣品粉末約0.4g，精密稱定，置于100mL圓底燒瓶中，加水50mL，稱定重量，靜置1h，加熱回流1h，取出，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾。精密吸取續(xù)濾液10mL，置100mL的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取2mL，置具塞的比色管中，精密加入4%苯酚溶液1mL，混勻，迅速精密加入濃硫酸7mL，搖勻，置40℃水浴中保溫30min，取出，放冷至室溫，即得供試品溶液。

2.2.2 苯酚溶液的制備 稱取已重蒸餾過(guò)的苯酚10.00g，置于250mL的容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，得濃度為4%的苯酚溶液，備用。

2.2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取濃度為903.00μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，8.0mL，分別置于6個(gè)100mL的容量瓶中，各加水稀釋至刻度，搖勻，得一系列濃度梯度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述濃度的對(duì)照品溶液2mL，置具塞比色管中，各精密加入4%苯酚溶液1mL，混勻，迅速精密加入濃硫酸7mL，搖勻，置40℃水浴中保溫30min，取出，放冷至室溫，同法做試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸計(jì)算，得多糖的回歸方程為：Y=0.0545X+0.0015，r=0.9994。結(jié)果表明多糖在4.52～14.45μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為903.00μg/mL的對(duì)照品溶液5mL，置于100mL的量瓶中，加水稀釋至刻度，得濃度為45.15μg/mL的對(duì)照品溶液，精密吸取上述對(duì)照品溶液2mL，顯色后分別進(jìn)行吸光度測(cè)定，以6次測(cè)得的吸光度計(jì)算RSD為2.49%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取按“2.2.1”項(xiàng)下制備的供試品(3月份采收樣品)溶液，分別在0，1，1.5，2，2.5，3h進(jìn)行吸光度測(cè)定，以測(cè)得的吸光度計(jì)算RSD為0.18%，表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份鉤藤樣品(3月份采收樣品)粉末，每份約0.4g，精密稱定，分別置于6個(gè)100mL圓底燒瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在488nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出該鉤藤藥材中的多糖(按葡萄糖計(jì))的平均含量為7.42%，RSD為2.06%。

2.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知多糖平均含量為7.42%的鉤藤樣品粉末6份，每份約0.2g，精密稱定，分別置于100mL圓底燒瓶中，每份分別精密加入濃度為281.18μg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液50mL，按“2.2.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在488nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果平均回收率為98.57%，RSD%為2.70。

2.2.8 含量測(cè)定 稱取鉤藤樣品，每樣各3份，每份約0.4g，精密稱定，按“2.2.1”項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法制備供試液，同法作試劑空白，用紫外-可見分光光度計(jì)在488nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算出多糖(按葡萄糖計(jì))的含量，結(jié)果見表3。

表3 毛鉤藤不同采收期總生物堿和多糖含量測(cè)定結(jié)果(n=3，%)

3 討論

多糖并非毛鉤藤的藥效成分，然而通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察到多糖含量與生物堿含量變化存在一定正相關(guān)性，可為分析毛鉤藤內(nèi)在質(zhì)量變化提供輔助信息[4]。

毛鉤藤中的總生物堿在全年通常氣溫相對(duì)較高的5～10月份時(shí)段含量相對(duì)較低，此時(shí)段多糖含量也呈現(xiàn)相應(yīng)含量較低的狀態(tài)，而在當(dāng)年11月到次年4月份氣溫相對(duì)較低時(shí)段總生物堿含量相對(duì)較高，此時(shí)段多糖含量也呈現(xiàn)相應(yīng)含量較高的狀態(tài)，說(shuō)明植物體內(nèi)糖份的積累變化與生物堿的含量變化基本一致，氣溫的高低是毛鉤藤中總生物堿及多糖含量有明顯直接影響的因素。因此貴州開陽(yáng)縣翁昭村毛鉤藤種植基地種植的毛鉤藤采收期應(yīng)選擇氣溫相對(duì)較低的時(shí)段采收為宜，與中國(guó)藥典2010版對(duì)鉤藤采收期于“秋、冬二季采收”敘述有一定差異，這或許與特定地點(diǎn)的地理環(huán)境和氣候有密切關(guān)系所致。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：240.

[2]曾常青,羅北亮.酸性染料比色法測(cè)定鉤藤的總生物堿含量[J].中藥材，2007，30(8)：1021-1024.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社.2010：206.

[4]蔣品，高言明，楊玉琴，等.龍膽不同采收期龍膽苦苷和多糖含量變化研究[J].江西中醫(yī)藥，2011,42(2)：55-57.