★ 鄭紹琴 宋健平 王琪 劉亞軍 裴晶 葉俏波

(1.廣州中醫(yī)藥大學科技產(chǎn)業(yè)園有限公司 廣州510445；2.廣州中醫(yī)藥大學 廣州 510405；3.廣州市醫(yī)藥職業(yè)學校 廣州 511455)

青蒿素(artemisinin,ART)是我國研究人員1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的倍半萜內(nèi)酯類化合物，此后陸續(xù)開發(fā)出青蒿琥酯(Artesunate,ATS)、雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)、蒿甲醚(artemether)等多種青蒿素類藥物。最初青蒿素為一種高效、低毒的抗瘧藥物，尤其是腦型瘧和惡性瘧有效。近來學者研究發(fā)現(xiàn)青蒿素具有抗腫瘤功效,對多種腫瘤具有抑制、殺傷作用[1-4]，有希望被開發(fā)成為新型的抗腫瘤植物藥。本研究以非小細胞肺癌A549和宮頸癌Hela細胞為對象，采用四甲基二氮唑藍(MTT)法檢測ART、DHA及ATS的體外抑制活性，觀察不同青蒿素類藥對不同腫瘤細胞的抗腫瘤作用。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 青蒿素(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究有限公司，批號為100651)；雙氫青蒿素(重慶華立武陵山制藥有限公司，批號為C00320110704-2)；青蒿琥酯(重慶華立武陵山制藥有限公司，批號為20080502)；5-氟尿嘧啶注射液(簡稱5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司生，生產(chǎn)批號：H31020593)；低糖DMEM、HEPES均購自美國GIBCO公司；小牛血清購自廣州畜牧場(批號20100618)；L-谷氨酰銨和MTT均購自Sigma公司；其他相關(guān)產(chǎn)品為國產(chǎn)試劑。

1.2 腫瘤細胞 非小細胞肺癌A549和宮頸癌細胞Hela，引自美國ATCC，由廣州中醫(yī)藥大學熱帶醫(yī)學研究所病毒實驗室凍存?zhèn)鞔９堋?/p>

1.3 儀器 美國寶特ELX800型全自動酶標儀；全自動CO2孵箱(上海力申科學儀器有限公司，型號：HF90)；倒置顯微鏡(日本Olympus，型號CK40)；海爾生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司，型號：HR40-ⅡA2)；SW-CJ-TF超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞接種 A549和Hela細胞常規(guī)復蘇后，待細胞生長至一定數(shù)量后，用0.25%胰酶消化1～5min，終止消化，并用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞。計數(shù)后用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5.0×105/mL，按0.1mL/孔接種于96孔細胞板上，37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。

2.2 A549和Hela細胞生長曲線的繪制 按2.1方法接種細胞，于接種后每24h做一次MTT染色。每天取4個復孔細胞進行MTT染色，分別連續(xù)12天和9天。最后結(jié)果以細胞MTT染色OD490為縱坐標，實驗時間為橫坐標，繪制出A549和Hela細胞的生長曲線。

2.3 加藥處理 待細胞貼壁培養(yǎng)1～2d后，吸掉原有培養(yǎng)基，將藥物分別配制成一定濃度，并對半稀釋，后一孔藥物濃度是前一孔的一半，放入37℃，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.4 MTT法檢測 將加入藥物的培養(yǎng)板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育72h后，每孔加入20μg/mL MTT溶液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中保溫4h，小心吸掉孔中原有培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩后靜置10min，待結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀測定A490nm值，并計算抑制率(%)=(1-實驗組OD值/空白對照組OD值)×100。

2.5 半數(shù)抑制濃度(IC50)計算 將配好的藥物用含10%的DMEM培養(yǎng)基稀釋，青蒿素100μg/mL、青蒿琥酯100μg/mL、雙氫青蒿素100μg/mL和5-Fu100μg/mL溶液，根據(jù)對半稀釋方法加藥，每個濃度設3個復孔，空白對照9個復孔，MTT法檢測，計算出不同濃度藥物的抑制率，將劑量與對應抑制率輸入Shmm公司IC50.exel.o版本軟件計算各藥物的IC50。

2.6 藥效結(jié)果判定 通過對A549和Hela細胞株的IC50值確定青蒿素類藥物在體外對這兩株腫瘤細胞的抑制活性。

3 實驗結(jié)果

3.1 A549細胞和Hela細胞的生長曲線 通過測得OD值繪制A549和Hela細胞的生長曲線如圖1和圖2。

圖1 A549細胞的動態(tài)生長曲線

圖2 Hela細胞的動態(tài)生長曲線

由上圖分析可示：這兩款細胞生長大致經(jīng)歷延滯期、對數(shù)生長期、平臺期、緩慢凋亡期、快速死亡期五期。細胞從培養(yǎng)24h開始進入對數(shù)生長期，24h到96h基本處于穩(wěn)定的平臺期，96h之后經(jīng)歷一個緩慢凋亡期，A549第4d達到頂峰，Hela細胞第5d達到頂峰，然后迅速進入快速死亡期。所以我們選擇細胞生長72h為干預點對細胞進行干預研究。

3.2 青蒿素類藥物對A549和Hela細胞的抑制活性 根據(jù)MTT法測得的OD值計算得到各類藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率見表1；以細胞增殖抑制率輸入Shmm公司IC50.exel.o版本軟件計算得到青蒿素類藥物對A549和Hela二株腫瘤細胞的抑制活性,見表2。

表1 青蒿素類藥物對A549細胞和Hela細胞的抑制率±s)

表2 青蒿素類藥物對A549細胞和Hela細胞的抑制活性/μg·mL-1

結(jié)果顯示：青蒿素、雙氫青蒿素及青蒿琥酯對二株腫瘤細胞有選擇性的抑制作用，且呈量效關(guān)系，隨著劑量的遞減，青蒿素類藥物對A549和Hela細胞的抑制率也逐漸下降。通過上表可以看出，雙氫青蒿素和青蒿琥酯對二株腫瘤細胞均有較強的抑制作用，但青蒿素對A549細胞的抑制活性較弱。利用IC50軟件測得青蒿素類藥物對A549和Hela細胞72h的IC50分別為:A549細胞(ATS27.97μg/mL、DHA43.90μg/mL)和Hela細胞(ART48.10μg/mL、ATS34.60μg/mL、DHA15.94μg/mL)。

3.3 討論 腫瘤是嚴重危害人類生命、健康的常見多發(fā)病。就全球而言，20世紀末的近20年間癌癥的發(fā)病率一直呈上升趨勢，其死亡率僅次于心血管病而位居第二[5]。對抗腫瘤藥物的研究是當今的一個熱點。在不斷研制新藥的同時,老藥新用也是研究抗腫瘤藥物的一個途徑，青蒿素類藥物近年來被廣泛用于抗腫瘤藥物的研究。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),青蒿素類藥物的作用機制主要是通過內(nèi)部的過氧化橋?qū)崿F(xiàn)的。它還可以通過阻滯細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成、與Fe2+作用的細胞毒作用、抑制端粒酶活性、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥和增加化療敏感性、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達以及損傷細胞線粒體等作用機制而實現(xiàn)抗腫瘤作用[6，7，8]。因此有必要進一步加強青蒿素類藥物抗腫瘤的研究。

本實驗室采用MTT法對青蒿素類藥物的抗腫瘤活性進行了兩株腫瘤細胞的系統(tǒng)性評價。從實驗結(jié)果可以看出，青蒿素在體外僅對二株腫瘤細胞中的Hela細胞有抑制活性，對A549細胞抑制活性較弱；而青蒿琥酯和雙氫青蒿素對二株腫瘤細胞均有抑制活性，且活性較好，但雙氫青蒿素對Hela細胞的抑制活性與青蒿琥酯相比較強，而對A549細胞抑制活性青蒿琥酯強于雙氫青蒿素。根據(jù)本實驗室對青蒿素類藥物體外抑制腫瘤活性研究的結(jié)果，青蒿琥酯和雙氫青蒿素對腫瘤細胞的抑制作用較強，而青蒿素抑制作用較弱。根據(jù)青蒿素類藥物對腫瘤細胞的選擇性抑制作用，在進行深入研究時，可以進行有針對性的研究。青蒿素類藥物抑制腫瘤細胞活性的差異性，提示我們這可能與化學藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙氫青蒿素為青蒿素經(jīng)四氫酸鈉還原所得，而青蒿琥酯的代謝產(chǎn)物是雙氫青蒿素，各衍生物的極性不同，或許會導致細胞對其攝取或結(jié)合的程度也不相同，從而影響藥物抗腫瘤活性。

[1]Disbrow G L,Baege A C,Kierpiec K A,et al.Dihydroartemisinin is cytotoxic to papillomavirus expressing epithelial cells in vitro and in vivo [J].Cancer Res, 2005, 65(23):10 854-10 861.

[2]Lee J, Zhou H J, Wu X H. Dihydroartemisinin down regulates vascular endothelial growth factor expression and induces apoptosis in chronic myeloid leukemia K562 cells [J].Cancer Chemother Pharmacol, 2006, 57(2): 213-220.

[3] Wang J, Guo Y, Zhang B C, et al. Induction of apoptosis an inhibition of cell migration and tube like formation by dihydroartemisinin in murine lymphatic endothelial cells [J].Pharmacology, 2007, 80 (4):207-218.

[4]Jiao Y, Ge CM, Meng QH ,et al. Dihydroartemisinin is an inhibitor of ovarian cancer cell Growth [J].Act a Pharmacol Sin, 2007, 28(7):1 045-1 056.

[5]鄭曉克.抗腫瘤藥物的研究進展[J].中山大學研究生學刊(自然科學、醫(yī)學版),2008,29(4):7-12.

[6]李燕飛,朱衛(wèi)平.青蒿素抗腫瘤作用的研究進展[J].熱帶醫(yī)學雜志,2009,9(3):341-342;274.

[7]于莎莎,佟麗斐,劉娜.青蒿素及其衍生物的抗腫瘤作用及其最新進展[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(12):234-235.

[8]孫雅潔,王京燕.青蒿素及其衍生物體外抗腫瘤活性研究[J].解放軍藥學學報，2010,4(26)：315-317.