張 盼，鄒 勝，黃晴菲，朱 槿，袁偉成，王啟衛(wèi)

(1.中國科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

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新型多肽固相合成鏈接子{4-[叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基芐基)]苯氧基乙酸}的合成*

張 盼1,2，鄒 勝1，黃晴菲1，朱 槿1，袁偉成1，王啟衛(wèi)1

(1.中國科學(xué)院 成都有機(jī)化學(xué)研究所，四川 成都 610041；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

以4-羥基苯甲酸和間苯二甲醚為原料，經(jīng)傅-克?；磻?yīng)、芐基保護(hù)、還原氨化、Boc保護(hù)氨基、脫芐基、親核取代反應(yīng)、酯水解等7步反應(yīng)合成了一個(gè)新型的多肽固相合成的鏈接子4-[叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基苯基)]苯氧基乙酸，總收率47.2%，純度>98%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR-MS確證。

多肽；固相合成；鏈接子；合成；工藝改進(jìn)

多肽是一種重要的生物活性物質(zhì)，已廣泛用于多肽藥物、多肽藥物載體及肽類食品和化妝品等領(lǐng)域[1]。目前，多肽的化學(xué)合成技術(shù)包括液相合成和固相合成兩種。其中固相法合成多肽省時(shí)、省力、省料、便于自動化等優(yōu)勢，已成為多肽合成的常規(guī)方法，并已擴(kuò)展到核苷酸合成等其他有機(jī)物領(lǐng)域[2]。

固相合成的關(guān)鍵步驟是將目標(biāo)分子連接到固相載體上，可通過能切割的連接基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。連接基團(tuán)可看作一種雙功能保護(hù)基，它一方面通過一種容易切割的不穩(wěn)定的鍵(如酯鍵、酰胺鍵等)與目標(biāo)分子相連，另一方面又通過一種相對穩(wěn)定的鍵(如碳-碳鍵、醚鍵等)把目標(biāo)分子固定在固相載體上。因此選擇理想的連接基團(tuán)直接關(guān)系到固相合成策略的成功[3]。

目前，在多肽固相合成中，使用最廣泛的連接基團(tuán)有兩種：Wang連接基團(tuán)(Ⅰ,Chart 1)[4]和Rink連接基團(tuán)(Ⅱ,Chart 1)[2-5]，其中Ⅱ因其可在溫和的條件下定量地使產(chǎn)物分子脫離下來，使其應(yīng)用更為廣泛。

Rink linker(Ⅲ，Chart 1)作為鏈接子已得到廣泛使用，主要用來合成肽鏈末端帶酰胺基的多肽，而酰胺基通常是多肽活性所必需的基團(tuán)。因此對Ⅲ的研究不僅具有一定的理論意義，還具有較大的實(shí)用價(jià)值。Takahashi等[6]報(bào)道了以4-羥基苯甲酸和間苯二甲醚為原料，經(jīng)傅-克酰基化反應(yīng)、親核取代、酯水解、還原氨化、Fmoc-OSu保護(hù)等5步反應(yīng)合成Ⅲ。該方法收率低(總收率35.8%)、反應(yīng)時(shí)間長、催化劑昂貴(PtO2催化劑)、溶劑用量大等，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

針對以上問題，本文在文獻(xiàn)[6]方法的基礎(chǔ)上對原工藝進(jìn)行了部分改進(jìn)，并設(shè)計(jì)了一條合成新型Rink類鏈接子RL1的新工藝路線。以4-羥基苯甲酸和間苯二甲醚為原料，經(jīng)傅-克酰基化反應(yīng)、芐基保護(hù)、還原氨化、Boc保護(hù)氨基、脫芐基、親核取代反應(yīng)、酯水解等7步反應(yīng)合成了用于多肽固相合成的鏈接子RL1——4-[叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基苯基)]苯氧基乙酸(Scheme 1)，總收率47.2%，純度>98%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR,13C NMR和HR-MS確證。

Ⅲ與RL1僅在NH上的保護(hù)基不同，我們期待RL1作為多肽固相合成鏈接子能廣泛應(yīng)用于多肽的固相合成中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Bruker-300型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));TOF 6244型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；SPD-10A型高效液相色譜儀(色譜柱C18)。

所用試劑均為工業(yè)品。

1．2 合成

(1)4-(1-氧代-2′,4′-二甲氧基芐基)苯酚(1)的合成[6]

在三口瓶中依次加入4-羥基苯甲酸5g(36.22mol)，間二甲氧基苯5.25g(38.02mmol)，氯化鋅5.48g(40.21mmol)和三氯氧磷16.6mL(0.18mol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下于60℃反應(yīng)4h(TLC監(jiān)測)。冷卻至室溫，緩慢倒入乙醇/水(V/V=1/1，20mL)中，攪拌，析出沉淀。過濾，濾餅干燥得淡紅色固體17.48g，收率80%；1H NMRδ: 7.74～7.71(d,J=8.65Hz,2H),7.35～7.33(d,J=8.21Hz,1H),6.87～6.85(d,J=8.63Hz,2H),6.55～6.51(m,2H),6.00～4.50(br,1H),3.86(s,3H),3.71(s,3H)。

(2)4-(1-氧代-2′,4′-二甲氧基芐基)-O-芐基苯酚(2)的合成[7]

在單口瓶中加入12.58g(10.00mmol)和丙酮20mL，攪拌使其溶解；加入碳酸鉀1.56g(11.20mmol)和芐溴2.05g(12.00mmol)，回流反應(yīng)3h(TLC監(jiān)測)。冷卻至室溫，減壓蒸除溶劑，加入乙醇/水(V/V=1/2)50mL，攪拌片刻，有沉淀析出。過濾，濾餅干燥得黃色固體23.38g，收率97%；1H NMRδ: 7.80～7.77(d,J=8.67Hz,2H),7.45～7.33(m,6H),6.99～6.96(d,J=8.71Hz,2H),6.56～6.52(d,J=6.17Hz,2H),3.87(s,3H),3.72(s,3H)。

(3)4-(1-氨基-2′,4′-二甲氧基芐基)-O-芐基苯酚(3)的合成[8-9]

在三口瓶中加入21.75g(5.03mmol)和甲苯25mL，攪拌使其溶解；冰浴冷卻，氨氣氛圍下加入TiCl41.5mL(6.03mmol)(反應(yīng)液呈紅色)，通氨氣20min(溶液顏色變?yōu)辄S色)，反應(yīng)過夜(TLC監(jiān)測)。加入飽和碳酸鉀溶液20mL，攪拌1h。過濾，濾液分液，水相用甲苯(3×10mL)萃取，合并有機(jī)相，用無水NaSO4干燥，濃縮后用甲醇(30mL)溶解，冰浴冷卻下，分批(2次)加入NaBH40.23g(6.03mmol)，反應(yīng)2h。加水10mL淬滅反應(yīng)，旋蒸除去甲醇，水相用CH2Cl2(3×10mL)萃取，合并萃取液，用無水NaSO4干燥,濃縮得淡黃色固體31.51g，收率86%；1H NMRδ: 7.46～7.30(m,7H),7.15～7.12(d,J=9.00Hz,1H),6.94～6.91(d,J=8.59Hz,2H),6.46～6.43(m,2H),5.40(s,1H),5.05(s,2H),3.79～3.78(d,6H),1.95(br,2H)。

(4)4-[1-叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基芐基)]-O-芐基苯酚(4)的合成

在單口瓶中加入33.49g(10.00mmol)和甲醇30mL，攪拌使其溶解；冰浴冷卻，加入K2CO30.69g(5.00mmol)，緩慢滴加(Boc)2O 2.5mL(10.87mmol)的甲醇(10mL)溶液，滴畢，反應(yīng)4h(析出固體，TLC檢測)。過濾，濾餅干燥得白色固體44.00g，收率89%；1H NMRδ: 7.14～7.12(m,3H),6.82～6.79(d,J=8.71Hz,2H),6.47～6.44(m,2H),5.97～5.95(d,J=7.83Hz,1H),5.54(br,1H),3.79(s,3H),3.70(s,3H),1.44(s,9H)。

(5)4-[1-叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基芐基)]苯酚(5)的合成[10]

在單口瓶中加入43.03g(6.75mmol)和甲醇50mL，攪拌使其溶解；加入10%Pd/C 0.3g，反應(yīng)5h(TLC檢測)。過濾，濾液濃縮得黃色固體52.23g，收率92%；1H NMRδ: 7.10～7.07(d,J=4.46Hz,1H),7.00～6.98(d,J=8.24Hz,2H),6.67～6.65(d,J=8.51Hz,2H),6.45～6.43(m,2H),5.95～5.93(d,J=7.28Hz,1H),5.62～5.60(br,1H),5.50～4.00(br,1H),3.78(s,3H),3.70(s,3H),1.45(s,9H)。

(6)4-[1-叔丁氧羰基氨基-(2′,4′-二甲氧基芐基)]苯氧基乙酸乙酯(6)的合成[6]

在反應(yīng)瓶中依次加入5360mg(1.01mmol)，溴乙酸乙酯2.02g(1.21mmol)，K2CO3170mg(1.21mmol)和丙酮20mL，攪拌下于回流(60℃)反應(yīng)4h。冷卻至室溫，減壓蒸餾除溶劑，殘余物加水15mL，攪拌，過濾，濾餅干燥得黃色固體60.40g，收率90%；1H NMRδ: 7.14(m,3H),6.81～6.79(d,J=8.61Hz,2H),6.46～6.44(m,2H),5.97～5.95(d,J=7.41Hz,1H),5.55(s,1H),4.57(s,2H),4.29～4.22(q,2H),3.79(s,3H),3.70(s,3H),1.44(s,9H),1.31～1.26(t,3H)。

(7)RL1的合成[6]

在反應(yīng)瓶中依次加入NaOH 50mg(1.18mmol)的水(20mL)溶液和6440mg(0.99mol)，攪拌下于室溫反應(yīng)過夜(TLC監(jiān)測)。用1mol·L-1鹽酸調(diào)至pH≈3，用乙酸乙酯(3×10mL)萃取，合并萃取液，用無水NaSO4干燥，濃縮得淡黃色固體RL10.40g，收率96%；1H NMRδ: 9.71(br,1H),7.15～7.12(m,3H),6.82～6.79(d,J=8.70,2H),6.50～6.43(m,2H),4.59(s,2H),3.81(s,3H),3.72(s,3H),1.45(s,9H);13C NMRδ: 172.8,160.2,157.9,156.3,155.5,135.9,129.3,127.7,122.6,114.2,103.9,99.2,81.1,79.7,64.9,55.3,54.2,28.4；HR-MSm/z: Calcd for C17H27O5{[M-BocNH]+} 301.12,found 301.11。

2 結(jié)果與討論

在合成1時(shí)，直接以POCl3為溶劑，避免了使用高沸點(diǎn)溶劑硝基苯，且收率提高至80%(64%[6]),反應(yīng)時(shí)間大大縮短。大量生產(chǎn)時(shí)多余的POCl3可以回收套用。

在還原氨化反應(yīng)中，以NH3作為原料，TiCl4為脫水劑，生成亞胺，再用NaBH4為還原劑，避免使用昂貴的金屬催化劑，降低了生產(chǎn)成本。

在合成6時(shí)，本文以溴乙酸乙酯為原料，與氯乙酸乙酯相比，前者反應(yīng)效率更高，縮短了反應(yīng)時(shí)間并大大降低了反應(yīng)溶劑用量。

與文獻(xiàn)[6]方法相比，該合成方法反應(yīng)過程中避免使用昂貴的催化劑、反應(yīng)效率高、后處理簡單、生產(chǎn)成本更低，有利于工業(yè)化制備。

[1] 許亞平,曹華.多肽藥物的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,26:653-657.

[2] Bruce Merrifield.Solide phase synthesis[C].Rockefeller University,New York,1984.Great Britain,1985:353-376.

[3] 秦斯民,余磊.固相多肽合成綜述[J].科技信息,2010,12:180.

[4] Ian W James.Linkers for solid phase organic synthesis[J].Tetrahedron,1999,55:4855-4946.

[5] Michael S Bernatowicz,Scott B Daniels,Hubert Koster.A comparison of acid labile linkage agents for the synthesis of peptide C-terminal amides[J].Tetrahedron Letters,1989,30(35):4645-4648.

[6] Seiji Sawada,Kumiko Yasui,Sho Takahashi.Improved synthesis of 4-[(R,S)-1-[1-(9H-Fluoren-9yl)-methoxycarbonylamino]-(2′,4′-dimethoxybenzyl)phenoxyacetic acid as a peptide-resin linker in the solid-phase synthesis of peptide-amides[J].Biosci Biotech Biochem,1992,56:1506-1507.

[7] Raymond C F Jones,Sze Chak Yau,James N lley.Synthesis of the pyoverdin chromophore by a biomimetic oxidative cyclization[J].Organic Letters,2009,11(7):15119-1522.

[8] Bruhaspathy Miriyala,Sukanta Bhattacharyya,John S Williamson.Chemoselective reductive alkylation of ammonia with carbonyl compounds:Synthesis of primary and symmetrical secondary amines[J].Tetrahedron,2004,6:1463-1471.

[9] Daniel G Brenner,Kathleen Mensler Cavolowsky,Kenneth L Shepard.A facile synthesis of sulfenimines derived from diaryl ketones[J].J Heterocyclic,1985,22:805-808.

[10] Jan Schraml,Magdalena Kvicalova,Vaclav Chvalovsky.29Si and13C NMR spectra of 4-substituted 2-methoxytrimethylsiloxybenzenes,factors determining the chemical shifts in models of lignin constituents[J].Magnetic Resonance in Chemistry,1990,28(11):973-978.

SynthesisofaNovelLinker4-[t-Butyloxycarbonylamino)-(2′,4′-dimethoxybenzyl)]phenoxyaceticAcidfortheSolid-phaseSynthesisofPeptide

ZHANG Pan，ZOU Sheng，HUANG Qing-fei， ZHU Jin, YUAN Wei-cheng, WANG Qi-wei

(1.Chengdu Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041,China;2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

A novel linker RL1{4-[t-Butyloxy carbonylamino)-(2′,4′-dimethoxybenzyl)]phenoxyacetic acid} in total yield of 47.2% with purity of over 98%,a linkage for the solid-phase synthesis of peptide,was synthesized by a seven-step reaction including F-C reaction,group protection,reductive amination,deprotection reactions,etc,using 4-hydroxybenzoic acid and 1,3-dimethoxybenzene as the starting materials.The structure was confirmed by1H NMR,13C NMR and HR-MS.

peptide;solid-phase synthesis;linker;synthesis;process improvement

2014-02-28

中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目

張盼(1988-)，女，漢族，湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事有機(jī)化學(xué)的研究。

王啟衛(wèi)，副研究員，E-mail: wqw@cioc.ac.cn

O625.3；O621.3

A

1005-1511(2014)05-0634-04