王春偉， 王 燕， 許允成， 崔麗麗， 高 潔

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

SPE-HPLC-MS/MS法測定人參及土壤中氟硅唑的殘留及風(fēng)險評估

王春偉1,2， 王 燕1， 許允成1， 崔麗麗2， 高 潔1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112)

【目的】明確人參和土壤中氟硅唑的殘留量，并對可能產(chǎn)生的膳食風(fēng)險進(jìn)行評估，以確保人參產(chǎn)品的質(zhì)量安全.【方法】 在集安市和撫松縣進(jìn)行2年試驗(yàn)，采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了400 g·L-1氟硅唑乳油在人參根及土壤中的殘留消解及最終殘留量，并采用風(fēng)險商值法對人參中氟硅唑可能產(chǎn)生的膳食風(fēng)險進(jìn)行了評估.【結(jié)果和結(jié)論】施藥劑量為90 g·hm-2(以有效成分計)時，氟硅唑在人參根和土壤中的降解半衰期分別為7.85～9.94和5.59～7.13 d.施藥劑量為60～90 g·hm-2時，施藥后35 d氟硅唑在人參根和土壤中的殘留量分別小于0.043 3和0.037 5 mg·kg-1.風(fēng)險商值為4.59×10-5，風(fēng)險較低，處于安全水平.建議我國在人參中氟硅唑的最大殘留限量值可暫定為0.05 mg·kg-1，安全間隔期為35 d.

人參； 氟硅唑； 殘留； 風(fēng)險評估； 固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

氟硅唑(Flusilazole)化學(xué)名稱為雙(4-氟苯基)-甲基-(1H-1，2，4-三唑-1-甲基)硅烷，是美國杜邦公司開發(fā)的含硅內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，為甾醇脫甲基化抑制劑，能破壞和阻止病菌麥角甾醇的合成，導(dǎo)致細(xì)胞膜不能形成，使病菌死亡[1].目前氟硅唑已應(yīng)用于多種作物上，可用于防治甜瓜炭疽病[2]、梨黑星病[3]、黃瓜黑星病[4]、葡萄白粉病[5].近年來研究發(fā)現(xiàn)氟硅唑?qū)θ藚⒑诎卟∮休^好防效，生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用[6].然而三唑類農(nóng)藥會干擾內(nèi)分泌，大量使用會對人類健康和環(huán)境產(chǎn)生危害[7]，近年來，歐盟和韓國已制定了氟硅唑在人參中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[8-9]，而我國尚未制訂人參中氟硅唑的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn).氟硅唑的檢測方法主要有氣相色譜法[10]，高效液相色譜法[11]，氣相色譜法-質(zhì)譜法[12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13].其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是以質(zhì)譜儀為檢測手段，具有靈敏度高、廣譜性強(qiáng)、抗干擾好等優(yōu)點(diǎn)，可利用色譜保留時間和質(zhì)譜特征離子對其相對豐度比等多重因素進(jìn)行準(zhǔn)確定性，比傳統(tǒng)色譜分析方法更加準(zhǔn)確、可靠.液相色譜-質(zhì)譜法已應(yīng)用于葡萄、蘋果、檸檬、番茄等多種蔬菜和水果中氟硅唑殘留量的檢測[13-16]，然而上述方法均為農(nóng)藥的多殘留檢測，存在操作繁瑣，有機(jī)溶劑用量大等缺點(diǎn)，并且人參中基質(zhì)成分復(fù)雜，含有多種皂甙、有機(jī)酸、多糖等，樣品凈化困難，易產(chǎn)生假陽性.本試驗(yàn)根據(jù)人參樣品基質(zhì)的特性，建立了人參及土壤中氟硅唑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，研究了氟硅唑在人參根及土壤中的殘留消解動態(tài)及最終殘留，建立了氟硅唑在人參中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，并對其可能產(chǎn)生的膳食安全風(fēng)險進(jìn)行評估，為氟硅唑在人參上的安全合理使用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為4年生大馬牙人參.

API 4000串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Applied Biosystems SCIEX公司)；Agilent1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Kromasil Eternity-5-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，粒徑5 μm，瑞典AKZO NOBEL公司)；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司)；X-22R離心機(jī)(10 000 r·min-1，美國Beckman coulter公司)；Vortex.Genie 2渦漩混勻器(德國IKA公司)；Milli-QA10去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)；LC51-GM 200刀式混合碾磨儀(10 000 r·min-1，德國RETSCH公司).

甲苯、丙酮、乙腈均為優(yōu)級純(美國TEDIA公司)；甲酸為分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；400 g·L-1氟硅唑乳油(美國杜邦公司)；氟硅唑標(biāo)準(zhǔn)品純度(w)99.5%(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心)；ProElut GPR固相萃取柱(粒徑1.5 g·12 mL-1，DIKMA公司).

1.2 試驗(yàn)方法

分別于2011年7月2日和2012年7月7日在吉林省撫松縣興參鎮(zhèn)榆樹村和集安市大地參業(yè)人參種植基地進(jìn)行2年殘留試驗(yàn)，采用背負(fù)式噴霧器對人參植株進(jìn)行葉片噴霧處理，按照用藥量由低到高的順序排列，避免交叉污染.小區(qū)面積為15 m2，每小區(qū)設(shè)3次重復(fù).

1.2.1 消解動態(tài)試驗(yàn) 采用在同一小區(qū)1次施藥、多次采樣的方法進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)高劑量和不施藥空白對照2個處理.施藥劑量為90 g·hm-2.施藥后0 (施藥后2 h之內(nèi))、1、3、7、14、21、28和35 d分別采集人參根及土壤樣品，每小區(qū)按對角線取5點(diǎn)，土壤樣品取土深度為0～10 cm，四分法留樣.同期采集空白樣品，標(biāo)記后于-20 ℃條件下保存待測.

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)2個濃度處理，分別為60和90 g·hm-2，施藥1次和2次，設(shè)不施藥空白小區(qū)作為對照.在施藥后28、35和60 d采集人參根和土壤樣品，土壤樣品采樣深度為0～15 cm，采樣方法同1.2.1.

1.2.3 樣品測定前處理 人參根樣品的制備：取不少于200 g的樣品，置于混合碾磨儀中粉碎，裝入聚乙烯塑料袋中，密封，-20 ℃保存.土壤：取風(fēng)干的土壤不少于200 g，過0.25 mm篩，混勻，裝入聚乙烯塑料袋中，密封，于-20 ℃保存.

提取：取5 g人參根及土壤樣品于50 mL離心管中，加入丙酮20 mL，渦漩混合1 min后以8 000 r·min-1離心5 min，取上清液，再向離心管中加入20 mL丙酮，重復(fù)提取1 次，合并上清液于35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈-甲苯(體積比3∶1)5 mL溶解，待凈化.

凈化：10 mL乙腈-甲苯(體積比3∶1)預(yù)淋洗GPR固相萃取柱，流出液棄去.將5 mL溶解液傾入固相萃取柱中，用20 mL乙腈-甲苯(體積比3∶1)進(jìn)行洗脫.收集全部洗脫液于雞心瓶中，于35 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干.用乙腈溶解，并定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后供 HPLC-MS/MS測定.

1.2.4 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Kromasil Eternity-5-C18，2.1 mm×150 mm；柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相：乙腈-甲酸溶液[體積比1∶1,ρ(甲酸)=0.190]；流速：250 μL·min-1；保留時間：6.98 min.電離方式為電噴霧電離源(ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓力為0.483 MPa；氣簾氣壓力為0.138 MPa；輔助加熱氣壓力為0.379 MPa；離子源溫度為350 ℃；定量離子(m/z)為316.2/247.1；定性離子(m/z)為316.2/247.1和316.2/165.0；去簇電壓為85 V；碰撞氣能量為26和37 eV.

1.2.5 殘留量計算 按下式計算試樣中每種農(nóng)藥的殘留量：

式中,X為試樣中被測農(nóng)藥殘留量(mg·kg-1)；Ai為樣液中被測農(nóng)藥的峰面積(或峰高)；Ais為標(biāo)準(zhǔn)工作液中農(nóng)藥的峰面積(或峰高)；Ci為標(biāo)準(zhǔn)工作液中農(nóng)藥的濃度(μg·mL-1)；V為樣液最終定容體積(mL)；m為最終樣液代表的試樣質(zhì)量(g).

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 準(zhǔn)確稱取氟硅唑標(biāo)準(zhǔn)品，置于100.0 mL容量瓶中，用丙酮定容至刻度配制成濃度100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用人參空白基質(zhì)液稀釋、定容，配制成質(zhì)量濃度為0.001、0.005、0.01、0.05、0.10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù).

1.2.7 添加回收率試驗(yàn) 取空白對照區(qū)人參根和土壤樣品進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，分別添加質(zhì)量濃度為0.01、0.02和0.20 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加試驗(yàn)設(shè)10次重復(fù)和1個對照，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.

1.2.8 風(fēng)險評估 按以下公式進(jìn)行農(nóng)藥的估計暴露量和風(fēng)險評估[17]：

w1=w0×m1÷m0; RQ=w1÷ADI.

式中w1為估計暴露量(mg·kg-1)；w0為理論殘留量(mg·kg-1)，m1為食物攝入量(kg)，m0為體質(zhì)量.楊大進(jìn)等[18]調(diào)查得出我國60 kg成人的中藥材保健食品每日攝入量約為0.000 57 kg，理論殘留量以2年2地試驗(yàn)高劑量施藥2次時人參根中最終殘留量的平均值計，體質(zhì)量以人均60 kg計.RQ為風(fēng)險商值；ADI為每日單位體質(zhì)量允許攝入量(mg·kg-1)，氟硅唑的ADI值為0.007 mg·kg-1[19].

當(dāng)RQ>1時，表示存在不可接受的較大風(fēng)險，數(shù)值越大，風(fēng)險越大；當(dāng)RQ<1時，表示風(fēng)險是可以接受的，數(shù)值越小，風(fēng)險越小.

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢出限

氟硅唑在0.001～0.10 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性方程為y=2.44×104x+4.68×104，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，其濃度與響應(yīng)值線性關(guān)系良好.以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，氟硅唑的檢出限為0.001 mg·kg-1.

2.2 添加回收率試驗(yàn)

由表1可知：氟硅唑在人參根及土壤的回收率分別為87.90%～92.00%和87.10%～91.50%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.83%～8.50%和5.68%～6.98%，符合殘留試驗(yàn)要求.

表1氟硅唑在人參根及土壤中的回收率1)

Tab.1Therecoveryrateofflusilazoleinginsengrootandsoil

樣品w(氟硅唑)/(mg·kg-1)平均回收率/%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差/%人參根0.0187.908.500.0292.005.920.2090.405.83土壤0.0188.605.680.0287.106.730.2091.506.98

1)n=10

2.3 殘留動態(tài)試驗(yàn)

由表2可知：施藥后35 d氟硅唑在人參根和土壤中的消解率均在90%以上，其消解動態(tài)符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程C=C0e-kt，降解半衰期分別為7.85～9.94和5.59～7.13 d，半衰期較短，屬于易降解農(nóng)藥(t1/2<30 d).

2.4 最終殘留試驗(yàn)

施藥后28 d氟硅唑在人參根和土壤中的殘留量分別為0.020 0～0.146 7和0.014 8～0.070 0 mg·kg-1；施藥后35 d氟硅唑在人參根和土壤中的殘留量分別為0.006 7～0.043 3和0～0.037 5 mg·kg-1；施藥后60 d氟硅唑在人參根和土壤中的殘留量分別為0～0.010 8和0～0.002 4 mg·kg-1(表3).

2.5 氟硅唑在人參中的風(fēng)險評估

400 g·L-1氟硅唑乳油在人參中的估計暴露量和風(fēng)險商值由1.2.8中公式計算得出，經(jīng)計算估計暴露量為3.21×10-7mg·kg-1，風(fēng)險商值為4.59×10-5(遠(yuǎn)小于1).因此，400 g·L-1氟硅唑乳油在1個生長季節(jié)施藥劑量為60～90 g·hm-2，施用1～2次，風(fēng)險較低，對消費(fèi)者安全.

表2 氟硅唑在人參根和土壤中的殘留動態(tài)Tab.2 Residual dissipation of flusilazole in ginseng root and soil

表3 氟硅唑在人參根及土壤中的最終殘留量1)Tab.3 Final residues of flusilazole in ginseng root and soil mg·kg-1

1)“—”表示未檢出.

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采用電噴霧電離源(ESI)，使樣品先帶電再噴霧，帶電液滴在去溶劑化過程中形成樣品離子，從而被檢測，適合分析極性強(qiáng)的大分子有機(jī)化合物，其最大特點(diǎn)是易形成多電荷離子，然而樣品基質(zhì)對離子化可能存在抑制作用，從而影響檢測結(jié)果的靈敏度與準(zhǔn)確性.分別以人參根及土壤空白樣品提取液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用來定量測定人參根及土壤中氟硅唑殘留量，以保證標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而消除樣品基質(zhì)效應(yīng).根據(jù)人參樣品基質(zhì)的特點(diǎn)及氟硅唑的理化特性，采用丙酮渦旋提取，GPR固相萃取柱凈化，建立了人參中氟硅唑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法.該方法操作簡便、快捷，僅需約1.5 h即可完成樣品的提取、凈化及測定，且精密度、靈敏度、回收率等方面均符合農(nóng)藥殘留檢測要求，能滿足生產(chǎn)上對氟硅唑殘留檢測的要求.

殘留動態(tài)試驗(yàn)結(jié)果表明：氟硅唑在人參根和土壤中的降解半衰期分別為7.85～9.94和5.59～7.13 d，半衰期較短，屬于易降解農(nóng)藥(t1/2<30 d).作為一種內(nèi)吸性較強(qiáng)的殺菌劑，在人參生長期施用后，氟硅唑會很快被人參植株吸收，并逐步運(yùn)輸?shù)礁?人參植株本身的生長發(fā)育狀況及生理生化特性都會影響氟硅唑的降解速率，另外不同的光照、溫濕度等外界因素也會對消解速率產(chǎn)生影響.

我國尚未制定氟硅唑在人參中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定氟硅唑在人參中的最大殘留限量值為0.05 mg·kg-1[8]，韓國為0.07 mg·kg-1[9].而我國規(guī)定氟硅唑在水果和蔬菜上的最大殘留限量值分別為0.20～1.00 mg·kg-1[19]，參照以上殘留限量規(guī)定及本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建議400 g·L-1氟硅唑乳油在人參中的最大殘留限量值可暫定為0.05 mg·kg-1，安全間隔期為35 d.在1個生長季節(jié)施藥量不高于90 g·hm-2，施用1～2次，風(fēng)險商值為4.59×10-5(遠(yuǎn)小于1)，風(fēng)險較低，在該劑量下施用后，人參在收獲后入藥及食用是安全的.

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【責(zé)任編輯霍 歡】

ResiduedeterminationbySPE-HPLC-MS/MSandriskassessmentofflusilazoleintheginsengandsoil

WANG Chunwei1, WANG Yan1, XU Yuncheng1, CUI Lili2, GAO Jie1

(1 College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2 Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, China)

【Objective】 To investigate flusilazole residues in ginseng and to conduct risk assessment.【Method】 A solid phase extraction (SPE) and high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (SPE-HPLC-MS/MS) method was developed to determine the residual dissipation and final residues of flusilazole 400 g·L-1EC in ginseng root and soil at Fusong County and Ji’an City in 2011 and 2012.The dietary risk assessment was also conducted using the calculation of risk quotient (RQ).【Result and conclusion】 The half-lives of flusilazole were 7.85-9.94 d in root and 5.59-7.13 d in soil at spraying dosage of 90 g·hm-2.Final residues of flusilazole were below 0.043 3 mg·kg-1in root and below 0.037 5 mg·kg-1in soil, and the risk was very low with 4.59×10-5(much less than 1) of a risk quotient, and the residues could be declined to the safe level over 35 days after spraying once or twice at a dosage ranging from 60 to 90 g·hm-2.It is recommended that the MRL of flusilazole in ginseng should be 0.05 mg·kg-1temporarily, and its preharvest interval should be set at 35 days.

ginseng; flusilazole; residue; risk assessment; SPE-HPLC-MS/MS

2013- 12- 19優(yōu)先出版時間2014- 09- 30

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20141003.1126.008.html

王春偉(1984—)，男，博士研究生，E-mail: chunwei314319@163.com；通信作者：高 潔(1964—)，女，教授，博士，E-mail：jiegao115@126.com

吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2011-Z24)；吉林省人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2011省財政廳)

王春偉， 王 燕， 許允成，等.SPE-HPLC-MS/MS法測定人參及土壤中氟硅唑的殘留及風(fēng)險評估[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,35(6):58- 62.

S481.8

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1001- 411X(2014)06- 0058- 05