陳 瑩， 張俊濤， 阮 琳

(廣州市園林科學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

園林廢棄物堆肥中木質(zhì)素降解菌的鑒定及其降解能力研究

陳 瑩， 張俊濤， 阮 琳

(廣州市園林科學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

【目的】篩選出具有木質(zhì)素降解功能的菌株，用于園林廢棄物降解.【方法】通過對從園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體中篩選得到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，得出目標(biāo)菌，并將該菌接種在滅菌的小葉榕枝條上，測定小葉榕枝條的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素含量.【結(jié)果和結(jié)論】結(jié)果表明，目標(biāo)菌為一株鏈霉菌Streptomycessp.；在小葉榕碎枝條上接種不同用量(5%、10%、15%)的該菌一級發(fā)酵液，培養(yǎng)45 d后，與對照相比，木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降低22.48%，半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降低26.60%.

園林廢棄物； 堆肥； 木質(zhì)素降解菌； DNA鑒定

近年來，全國各地城市綠化發(fā)展迅速，2012年，我國城市建成區(qū)綠化覆蓋率達(dá)39.2%，綠地率達(dá)35.3%[1]，而且呈逐年增加的趨勢.但隨之也產(chǎn)生了大量的園林廢棄物，包括枯枝落葉、喬木灌木修剪物、草坪修剪物、殘花等.利用傳統(tǒng)的焚燒和填埋處理手段處理此類有機(jī)質(zhì)含量高、營養(yǎng)元素齊全、污染成分少的廢棄物資源，不僅會造成氣體或水體污染，也會造成資源浪費(fèi)，不符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)和建設(shè)節(jié)約型社會的思路[2-5].堆肥資源化是利用物理、化學(xué)及生物技術(shù)，通過高溫好氧發(fā)酵降解園林廢棄物進(jìn)而生產(chǎn)土壤改良劑、營養(yǎng)基質(zhì)、有機(jī)肥等產(chǎn)品，實(shí)現(xiàn)園林廢棄物在城市綠化生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的循環(huán)利用，并具有廣闊應(yīng)用前景的處置方式[6-8].然而，園林廢棄物尤其是木本植物殘體的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木質(zhì)素包圍著纖維素，兩者結(jié)合形成極難降解的“木質(zhì)纖維素”，難以被大多數(shù)微生物直接作為能源物質(zhì)轉(zhuǎn)化，嚴(yán)重限制了園林廢棄物降解的效率[9-10].因此，破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)是加快園林廢棄物降解、提高其資源化利用的前提條件，目前的方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法[11-12]，其中，生物法以其降解率高、能耗低、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)而備受推崇.

自然界參與降解木質(zhì)素的微生物有真菌、放線菌和細(xì)菌.目前，國際上以真菌的研究居多，如白腐真菌[13-16].我國在木質(zhì)素降解微生物方面的研究起步較晚, 具有較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力的菌種匱乏，而且目前研究最多的木質(zhì)素降解菌，如白腐菌中的黃孢原毛平革菌Phanerochaetechrysosporium等，是低溫木質(zhì)素降解菌，環(huán)境的改變會影響其木質(zhì)素降解率[10]，因此，篩選適于園林廢棄物堆肥的微生物菌株具有重要意義.本研究從園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體中分離出菌株并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，得到對木質(zhì)素具有降解能力的菌株，為培育適于園林廢棄物高溫好氧堆肥的木質(zhì)素降解菌提供科學(xué)依據(jù)，也為提高園林廢棄物堆肥資源化效率提供一條可行的途徑.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 由廣州市綠風(fēng)生物技術(shù)有限公司園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體中篩選得到.

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 000 mL.

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，氯化鈉0.5 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 000 mL.

虎紅培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，葡萄糖10.0 g，孟加拉紅(虎紅)0.033 g，氯霉素0.1 g，瓊脂18～20 g，蒸餾水1 000 mL.

1.1.3 小葉榕碎枝條 取自廣州市綠風(fēng)生物技術(shù)有限公司，粒徑≤3 cm，含水量42.32%.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的采集、分離、純化 于園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體5個不同點(diǎn)位取堆肥樣品，并將其混勻.稱取樣品10.0 g，根據(jù)逐級稀釋法[17]得1×10-1～1×10-7系列稀釋度的菌懸液.根據(jù)LB培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基配方依次配制成細(xì)菌培養(yǎng)基(簡稱LB)、放線菌培養(yǎng)基(簡稱G)和真菌培養(yǎng)基(簡稱H).將1×10-4～1×10-6稀釋度的菌懸液涂平板于LB培養(yǎng)基表面，每種稀釋度重復(fù)3次；將1×10-3～1×10-5稀釋度的菌懸液涂平板于G培養(yǎng)基表面，每種稀釋度重復(fù)3次；將1×10-1～1×10-3稀釋度的菌懸液涂平板于H培養(yǎng)基表面，每種稀釋度重復(fù)3次；每種培養(yǎng)基以涂無菌水為對照(CK)，各重復(fù)3次.將1×10-6稀釋度的LB培養(yǎng)基、1×10-5稀釋度的G培養(yǎng)基和1×10-3稀釋度的H培養(yǎng)基上生長的菌，根據(jù)外觀形態(tài)用劃線法進(jìn)行分離、純化(培養(yǎng)溫度為50 ℃).

1.2.2 菌株的鑒定 將分離純化得到的11株菌株(編號分別為H1、H2、G1、G2、LB1～LB7)，經(jīng)過DNA序列分析結(jié)果進(jìn)行鑒定.基因組DNA的提取參考江曉等[18]的方法.菌株LB1～LB5的DNA采用細(xì)菌的16S rRNA通用引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，其引物序列為：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).菌株H1、H2、G1、G2 、LB6和LB7的DNA采用真菌的ITS通用引物PCR擴(kuò)增真菌，其引物序列為：27F(ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC)；ITS5:GGAAGTAAAAGT-CGTAACAAGG).DNA序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行.

1.2.3 木質(zhì)素降解能力測定 在無菌條件下，用接種環(huán)輕挑成熟的木質(zhì)素降解菌，將其接入裝有高氏一號培養(yǎng)液的三角瓶中，置旋轉(zhuǎn)式搖床(30 ℃，160 r/min)，培養(yǎng)5～7 d，即得一級發(fā)酵液.

稱取10.00 g的小葉榕碎枝條于培養(yǎng)皿中，在160 ℃的烘箱內(nèi)滅菌2.5 h.在無菌條件下，向裝有小葉榕碎枝條的培養(yǎng)皿中分別加入5 mL無菌水潤濕，放置過夜.本試驗(yàn)設(shè)置4個處理，其中：T1、T2、T3處理分別為接種木質(zhì)素降解菌一級發(fā)酵液5 mL(接菌量為5%)、10 mL(接菌量為10%)，和15 mL(接菌量為15%)，以添加滅菌的高氏一號營養(yǎng)液10 mL為對照(CK)，每個處理重復(fù)3次.于30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，45 d后，取樣進(jìn)行纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量測定[19].

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的采集、分離和純化

經(jīng)過菌種的采集、分離和純化，從園林廢棄物高溫好氧發(fā)酵堆體中篩選得到8株菌株，編號分別為H1、LB1～LB7.

2.2 菌株的序列測定

菌株LB1～LB5的DNA采用16S rRNA通用引物PCR擴(kuò)增；菌株H1、LB6和LB7的DNA采用真菌的ITS通用引物PCR擴(kuò)增，分別進(jìn)行DNA電泳測序，擴(kuò)增片段進(jìn)行純化， DNA片段大小見表1；16S rDNA電泳圖和PCR擴(kuò)增電泳圖以菌株LB4為例(圖1)；PCR產(chǎn)物經(jīng)過上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，分別將各菌種的測序結(jié)果在國際互聯(lián)網(wǎng)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)基因庫(Gene bank)上用BLAST對菌株序列進(jìn)行搜索，其中菌株LB3相似性為93%，不足以鑒定到屬名，為未知名菌；菌株LB7與編號AM930339.1和JF227580.1的菌株相似度最高，相似性為99%，但這兩株菌株均未知屬名，故菌株LB7也為未知名菌；其余菌株比對結(jié)果詳見表1.

表1 基因庫中序列比對結(jié)果Tab.1 The DNA sequence alignment from GenBank

M1： -Hind Ш digests；M 、M2：DNA marker DL2000.

Fig.1 16S rDNA electrophoragram (a), the electrophoresis results of PCR segment(b) and the electrophoresis of the cloned fragment(c) on strain LB4

通過DNA序列比對，各菌株的鑒定結(jié)果見表2.大量研究表明[20-33]：菌株LB1～LB7和H1分別具有不同功能，僅菌株LB4具有降解木質(zhì)素、纖維素、廢水、原油等的能力[24-27]，故在鑒定結(jié)果中選擇菌株LB4(鏈霉菌Streptomycessp.)作為目標(biāo)菌，對其木質(zhì)纖維素降解能力進(jìn)行測定，其菌落形態(tài)見圖2，顯微鏡圖見圖3.

表2 菌株的DNA序列鑒定結(jié)果Tab.2 Results of 16S rDNA sequence analysis of the strains

圖2 LB4菌株的平板菌落Fig.2 The flat colonies of strain LB4

圖3 LB4菌株的顯微形態(tài)(標(biāo)尺=5 μm)Fig.3 The microphone of strain LB4 (scale bar = 5 μm)

2.3 木質(zhì)素降解能力測定

接種菌株LB4培養(yǎng)45 d后，小葉榕枝條中的木質(zhì)素和半纖維素含量降低(表3).菌株LB4接種量不同，小葉榕枝條中的木質(zhì)素和半纖維素含量降幅不同.與對照相比，接種量5%、10%、15%的3個處理木質(zhì)素含量降幅依次為3.79%、21.63%和22.48%，半纖維素含量降幅依次為23.55%、26.60%和22.56%.總體上，菌株LB4接種量為10%和15%時，木質(zhì)素含量和半纖維素含量降幅均達(dá)顯著性水平，但10%和15%的接種量間并無顯著差異，綜合性價比等因素考慮，菌株LB4用于降解園林廢棄物的適宜用量為10%.

表3LB4菌株各處理樣品中木質(zhì)素、半纖維素、纖維素含量1)

Tab.3Thedeterminatedcontentsoflignin,celluloseandhemi-celluloseineachtreatmentofstrainLB4

處理接種量/%w/%木質(zhì)素半纖維素纖維素CK017.66±0.62a23.27±0.06a54.95±1.82aT1516.99±1.51a17.79±0.67b52.64±0.06aT21013.84±0.64b17.08±0.50b55.27±2.32aT31513.69±0.28b18.02±1.07b56.67±1.15a

1) 表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后凡具有一個相同字母者表示差異不顯著(P>0.05，Duncan’s法).

3 討論與結(jié)論

園林廢棄物高溫好氧堆肥是實(shí)現(xiàn)其循環(huán)利用的理想途徑，而利用生物方法加速園林廢棄物降解又是提高園林廢棄物資源化效率的有效方法[34].目前，國際上關(guān)于木質(zhì)素降解菌的研究以真菌居多[35-37]，如白腐真菌，但此類菌屬低溫木質(zhì)素降解菌，高溫的園林廢棄物堆體環(huán)境會影響其木質(zhì)素降解率.本研究應(yīng)用原位篩選從園林廢棄物高溫好氧堆體中提取出具有木質(zhì)素降解功能的菌株，通過分子學(xué)鑒定，該菌為鏈霉菌Streptomycessp.，不僅開拓了篩選高溫木質(zhì)素降解菌的途徑，而且將木質(zhì)素降解菌的研究對象拓展至放線菌[38].木質(zhì)素降解能力測定試驗(yàn)也表明該菌可顯著降低小葉榕枝條木質(zhì)素和半纖維素含量，當(dāng)該菌發(fā)酵液接種量達(dá)到10%時，經(jīng)45 d培養(yǎng)，小葉榕枝條中木質(zhì)素含量降幅達(dá)21.63%，半纖維素含量降幅達(dá)26.60%.

本研究通過試驗(yàn)證實(shí)了從園林廢棄物高溫好氧堆體中提取的鏈霉菌Streptomycessp.具有一定的木質(zhì)素降解能力，但該菌的特性、降解機(jī)理和接種量等都有待進(jìn)一步研究.

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【責(zé)任編輯李曉卉】

Identificationanddegradationabilityoflignindegradationisoaltesfromlandscapingwastecompost

CHEN Ying, ZHANG Juntao, RUAN Lin

(Guangzhou Institute of Landscape Gardening, Guangzhou 510405, China)

【Objective】 A strain with the ability of lignin degradation was screened from landscaping waste compost.【Method】The obtained isolates were identified by molecular identification; the lignin degradation isolates were inoculated into sterilizedFicusmicrocarpavar.pusillifoliawattle to study the degradation ability, including analyses of the content of lignin, cellulose and hemicellulose of the wattle respectively.【Result and conclusion】 The results showed that the lignin degradation isolates were identified asStreptomycessp.Compared with non-inoculated treatments, samples inoculated with different dosages (5%, 10%, 15%) of the bacteria fermentation liquid intoFicusmicrocarpabroken branches, respectively, the lignin content could be reduced by 22.48%, hemicellulose content could be reduced by 26.60% after 45 d incubation.

landscaping waste; compost; lignin degradation strain; DNA identification

2013- 09- 02優(yōu)先出版時間2014- 10- 03

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20141003.1116.006.html

陳 瑩(1983—)，女，助理研究員，碩士，E-mail：fanchuanyu2006@163.com；通信作者：張俊濤(1981—)，男，助理研究員，碩士，E-mail：zjt811027@sohu.com

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011A030600002，2012A030600009);廣州市科技和信息化局民生科技重大專項(xiàng)(201300000128)

陳 瑩， 張俊濤， 阮 琳.園林廢棄物堆肥中木質(zhì)素降解菌的鑒定及其降解能力研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014,35(6):94- 98.

S182

A

1001- 411X(2014)06- 0094- 05