馬建青，李祥龍,2*，周榮艷，李蘭會(huì)，楊清芳

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；3.河北省邢臺(tái)市農(nóng)業(yè)局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 邢臺(tái) 054001)

科學(xué)研究

ASIP蛋白與AgRP相關(guān)蛋白生物信息比較分析

馬建青1，李祥龍1,2*，周榮艷1，李蘭會(huì)1，楊清芳3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 昌黎 066600；3.河北省邢臺(tái)市農(nóng)業(yè)局動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北 邢臺(tái) 054001)

利用生物信息學(xué)的方法研究人、綿羊和牛等18個(gè)物種Agouti 信號(hào)蛋白(ASIP)和Agouti 相關(guān)蛋白(AgRP)的編碼區(qū)及其對(duì)應(yīng)氨基酸序列的相關(guān)特征，以期探明兩種蛋白的遺傳分化特點(diǎn)。結(jié)果表明，在ASIP與AgRP均為399bp的CDS序列中，其核苷酸保守區(qū)域的位置分別在262～399 bp和230～399 bp處；ASIP和AgRP在各自CDS序列多態(tài)位點(diǎn)變異的各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值及其百分率大小上均極為接近；在46條ASIP的CDS序列及32條AgRP的CDS序列中，二者的單倍型數(shù)分別為22種和23種，ASIP和AgRP在基因的進(jìn)化以及不同物種的遺傳分化上具有相似性；兩者的氨基酸序列在98～140 aa片段處保守性較高，該區(qū)域同時(shí)富含半胱氨酸(Cys)；ASIP和AgRP一級(jí)結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)表現(xiàn)為共性與差異并存；二者的肽鏈C端具有相似的三維結(jié)構(gòu)，但各自也具有其結(jié)構(gòu)特異性。

Agouti；ASIP；AgRP；生物信息學(xué)

Agouti基因，通常翻譯成“南美豚鼠外表顏色基因”[1]或者“刺豚鼠毛色基因”、“鼠灰色基因”[2]。Agouti信號(hào)蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)是Agouti基因編碼的產(chǎn)物。繼ASIP發(fā)現(xiàn)之后，研究人員在尋找Agouti同源基因時(shí)又發(fā)現(xiàn)了此同源基因編碼的一種與蛋白ASIP的大小與結(jié)構(gòu)相似的同源蛋白，即Agouti相關(guān)蛋白(Agouti-related protein,AgRP)[3-4]。

已有研究表明，ASIP發(fā)揮生物學(xué)功能是通過與黑素皮質(zhì)素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的受體(melanocortin receptors,MC-R,如MC1-R、MC3-R及MC4-R) 相互作用，從而影響動(dòng)物皮毛顏色的形成、能量代謝、肥胖、糖尿病以及腫瘤的發(fā)生和性功能等[5-6]。而AgRP的生物學(xué)功能是作為一種攝食神經(jīng)肽，通過拮抗α-黑素細(xì)胞刺激素與之競爭結(jié)合MC3-R及 MC4-R受體，促使機(jī)體攝取更多的食物，增加能量，引起多食和肥胖癥的發(fā)生[3]。由此可見，二者均對(duì)生物體能量代謝調(diào)控具有重要作用，且均可導(dǎo)致機(jī)體肥胖。

為探究兩種蛋白在核苷酸序列和氨基酸序列水平上的相似性和差異性及其二者的聯(lián)系，本文利用生物信息學(xué)的方法研究了人(Homosapiens)、綿羊(Ovisaries)和牛(Bostaurus)等18個(gè)物種ASIP和AgRP的完全編碼區(qū)及對(duì)應(yīng)氨基酸序列的相關(guān)特征，旨在探明兩種蛋白的遺傳分化特點(diǎn)，為生物體的能量代謝調(diào)控、肥胖癥和糖尿病等疾病的發(fā)生和動(dòng)物遺傳育種研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 序列來源

ASIP和AgRP的完全編碼區(qū)(CDS)序列和氨基酸序列從NCBI網(wǎng)站的GenBank中下載，本研究分別下載了人、綿羊、牛、家貓、野豬、褐家鼠、黑猩猩、大猩猩、東非狒狒、獼猴、北美鼠兔、小家鼠、虎鯨、歐洲兔、家馬、小耳大嬰猴、大熊貓和非洲象共計(jì)18個(gè)不同物種的46條ASIP的CDS序列和18條氨基酸序列及32條AgRP的CDS序列和18條氨基酸序列(表1)。

表1 ASIP和AgRP CDS區(qū)序列和氨基酸序列來源Table 1 The CDS sequence and amino acid sequences of ASIP and AgRP

注：第2、3、4列中加粗字體代表AgRP的序列信息，不加粗字體代表ASIP的序列信息。

Note:In the 2nd,3rd and 4th column,the bold fonts denote the sequences information of AgRP,while the normal fonts denote the sequence information of ASIP.

1.2 分析方法

首先對(duì)表1中46條ASIP的CDS序列及32條AgRP的CDS序列以及兩種蛋白的各18條氨基酸序列用生物學(xué)軟件BioEdit分別進(jìn)行比對(duì)分析，然后編輯共有的編碼區(qū)和氨基酸序列進(jìn)行比較，分析比對(duì)后的序列特征。二者遺傳多態(tài)性的各項(xiàng)指標(biāo)及單倍型的生成利用DnaSP5.10軟件進(jìn)行分析。 在線軟件工具ProtParam用來分析ASIP和AgRP氨基酸序列的理化性質(zhì)。蛋白質(zhì)同源建模SWISS-MODEL軟件用來預(yù)測(cè)ASIP和AgRP蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASIP及AgRP的CDS序列特征

2.1.1 保守區(qū)域分析 在所分析的均為399個(gè)位點(diǎn)的ASIP和AgRP的CDS序列中，二者核苷酸保守區(qū)域的位置分別在262～399 bp和230～399 bp處，各自的序列保守度值(Sequence conservation)很相近(0.491和0.476)，保守區(qū)域的保守閾值(Conservation threshold)分別為59和57。

2.1.2 多態(tài)位點(diǎn)變異 在所研究的不同物種46條ASIP的CDS序列及32條AgRP的CDS序列中，共計(jì)發(fā)現(xiàn)有多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為203和207個(gè)，其百分率分別約為50.9%和51.9%，其中包含的單一多態(tài)位點(diǎn)數(shù)各為63個(gè)和64個(gè)，其百分率各約為15.8%和16.8%；二者所擁有的簡約多態(tài)位點(diǎn)分別為140個(gè)和143個(gè)，其百分率分別約為35.1%和35.8%；突變總數(shù)各為258個(gè)和288個(gè)(表2)。分析顯示,ASIP和AgRP二者在各自CDS序列多態(tài)位點(diǎn)變異的各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)應(yīng)的數(shù)值大小及其百分率上均極為接近。就二者各自的突變總數(shù)來看，ASIP的CDS區(qū)中包含258個(gè)，AgRP的CDS區(qū)中包含288個(gè)，相差數(shù)目比其他指標(biāo)變化較大。

表2 ASIP及AgRP的CDS序列多態(tài)信息Table 2 The polymorphic information of CDS sequences of ASIP and AgRP

注:括號(hào)中數(shù)字為百分率。

Note: The values in the brackets are percentages.

2.1.3 單倍型及其多樣性 根據(jù)序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)二者的單倍型數(shù)分別為22種和23種。二者各自單倍型所包括序列信息見表3和表4。由表中的信息可以看出在兩種蛋白各自的完全編碼區(qū)中，人、小家鼠和野豬三個(gè)物種均分化出不同種類的單倍型。此外，ASIP的CDS序列中，大猩猩和綿羊以及AgRP的CDS序列中的牛分別分化出了不同種類的單倍型。同時(shí)由軟件計(jì)算出的二者單倍型(基因)多樣性值較為接近(分別為0.964和0.939)，而二者的核苷酸多樣性值分別為0.146和0.113，核苷酸差異平均數(shù)分別為57.522和45.160。

2.2 ASIP及AgRP的氨基酸序列特征

2.2.1 蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)分析 AgRP與ASIP在氨基酸序列上具有25%相似性,且C端含有特征性的半胱氨酸(Cys)結(jié)構(gòu)域[3]。利用BioEdit軟件對(duì)比對(duì)后的兩種蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者在氨基酸序列98～140 aa約40個(gè)氨基酸片段處保守性較高，該區(qū)域同時(shí)富含Cys，見圖1。

2.2.2 氨基酸序列理化性質(zhì)分析 利用在線軟件ProtParam分析ASIP以及AgRP的氨基酸序列理化性質(zhì)見表5。將表2中兩種蛋白所對(duì)應(yīng)物種的氨基酸序列經(jīng)軟件分析后，求取各項(xiàng)指標(biāo)的算術(shù)平均值。分析及計(jì)算結(jié)果的表明，ASIP及AgRP的平均分子量基本相同，ASIP的疏水性均值和脂溶指數(shù)均值都要小于AgRP對(duì)應(yīng)的值，而ASIP的理論等電點(diǎn)均值和不穩(wěn)定系數(shù)均值均大于AgRP相對(duì)應(yīng)的值。

2.2.3 ASIP和AgRP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由上述可知，ASIP和AgRP在富含Cys的C端氨基酸序列較為保守且同源性較高，而且也已有研究表明，ASIP和AgRP在其C末端具有相似的三維空間結(jié)構(gòu)，但是二者在發(fā)揮生物學(xué)功能的時(shí)候是通過結(jié)合不同的黑素皮質(zhì)素受體實(shí)現(xiàn)的[3]。為了探究這一問題的原因，本研究中利用蛋白質(zhì)同源建模SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)構(gòu)建了ASIP及AgRP蛋白C末端的三維空間結(jié)構(gòu)見圖2。從預(yù)測(cè)的結(jié)果分析，ASIP與AgRP多肽鏈在C端具有相似的三維結(jié)構(gòu)，雖然二者為同源蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上仍存在明顯差異。AgRP肽鏈C端的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)β-折疊片段，而且在這一β-折疊的側(cè)鏈中有三個(gè)重要的芳香族氨基酸殘基即109位和118位的酪氨酸(Tyr)及116位的苯丙氨酸(Phe)，這一片端的穩(wěn)定性對(duì)于AgRP蛋白的氧化折疊極為關(guān)鍵[7-8]。Joseph等[8]由AgRP蛋白C端的二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)在與AgRP蛋白同源的C端區(qū)域，ASIP蛋白包含兩個(gè)芳香族氨基酸殘基。

表3 各單倍型在ASIP的CDS序列中的分布Table 3 The distribution of CDS sequences of ASIP for each haploid

表4 各單倍型在AgRP的CDS序列中的分布Table 4 The distribution of CDS sequences of AgRP for each haploid

圖1 ASIP和AgRP蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸保守度差異比較Fig.1 Conserved amino acid difference comparison for the protein primary structure of ASIP and AgRP

注： 1，19.代表物種人；2，28.獼猴；3，33.黑猩猩；4，23.野豬；5，22.小家鼠；6，25.家馬；7，26.家貓；8，24.歐洲兔；9，34.東非狒狒；10，20.褐家鼠；11，27.黑猩猩；12，29.北美鼠兔；13，31.小耳大嬰猴；14，30.虎鯨；15，35.大熊貓；16，21.牛；17，36.非洲象；18，32.綿羊。柱形圖表示氨基酸種類保守度差異，其中氨基酸保守度半胱氨酸>苯丙氨酸和丙氨酸>精氨酸和纈氨酸。

Note:1，19.representHomosapiens；2，28.Macacamulatta；3，33.Pantroglodytes；4，23.Susscrofa；5，22.Musmusculus；6，25.Equuscaballus；7，26.Feliscatus；8，24.Oryctolaguscuniculus；9，34.Papioanubis；10，20.Rattusnorvegicus；11，27.Pantroglodytes；12，29.Ochotonaprinceps；13，31.Otolemurgarnettii；14，30.Orcinusorca；15，35.Ailuropodamelanoleuca；16，21.Bostaurus；17，36.Loxodontaafricana；18，32.Ovisaries).The histogram stands for difference of conservative degrees which is Cysteine>Phenylalanine and alanine>Arginine and valine.

表5 ASIP和AgRP氨基酸序列理化性質(zhì)參數(shù)Table 5 Physicochemical property parameter of amino acid sequences for ASIP and AgRP

圖2 ASIP和AgRP蛋白C端三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(左：ASIP;右：AgRP)
Fig.2 Tertiary structure prediction of C-terminal of ASIP and AgRP(left: ASIP,right: AgRP)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)ASIP和AgRP兩種蛋白在各自的CDS區(qū)中存在同源性較高的保守核苷酸序列，且它們的位置很相近。二者的序列保守度值和保守區(qū)域閾值也很相近，且在基因表達(dá)方面，細(xì)胞中核苷酸的排列順序指導(dǎo)蛋白質(zhì)的生成，由此推測(cè)二者在相似位置上核苷酸序列的同源性和保守性是使二者進(jìn)化為同源蛋白的基礎(chǔ)之一。二者CDS序列中的可變多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單一多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和簡約多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及其各自所占的百分率數(shù)值基本一致，由此判斷ASIP和AgRP在基因的進(jìn)化上以及不同物種的遺傳分化上具有相似性。但是同時(shí)發(fā)現(xiàn)二者在突變總數(shù)這一指標(biāo)上差別明顯。雖然在它們的CDS區(qū)中存在同源性較高的保守序列，但仍有較大的突變總數(shù)差異，這也說明了AgRP的基因多態(tài)性相比ASIP豐富一些。另外，出現(xiàn)這一情況的原因可能在于選取的兩種蛋白的CDS序列數(shù)的差別較大，亦或是所選序列的基因本身存在突變特異性所致。由二者單倍型種類也推斷出了編碼ASIP和AgRP的兩種基因在物種間和物種內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的遺傳分化，且二者在遺傳分化方面具有相似性和各自的分化特點(diǎn)。對(duì)于本研究中Hap-7黑猩猩和大猩猩歸屬于同一種單倍型，這與動(dòng)物分類學(xué)相符合，而本研究中卻未出現(xiàn)此情況，出現(xiàn)這個(gè)問題的原因可能是因?yàn)楸狙芯恐羞x取的序列條數(shù)有限也可能是由于二者編碼蛋白的基因本身的變異特異性造成的。

作為同源蛋白的ASIP和AgRP在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上的相似性與差異性是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究通過比對(duì)ASIP和AgRP蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)出了兩蛋白氨基酸保守序列，得到的結(jié)果與前人研究結(jié)論一致[14]。富含Cys的保守區(qū)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成具有重要作用。二硫鍵是由處在同一肽鏈不同位置或不同肽鏈中的兩半胱氨酸側(cè)鏈的巰基(-SH)氧化后相連接而成，是一種比較穩(wěn)定的共價(jià)鍵。在有二硫鍵存在的蛋白質(zhì)中，二硫鍵對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有很重要的作用。Cys中含有巰基，因此推測(cè)在ASIP和AgRP兩蛋白的C端富含的10個(gè)Cys會(huì)因氧化作用形成多個(gè)二硫鍵，這便穩(wěn)定了兩蛋白的高級(jí)構(gòu)象。而且ASIP與AgRP蛋白之所以均會(huì)與不同類型的黑素皮質(zhì)素受體結(jié)合很可能與蛋白本身二硫鍵維持的高級(jí)構(gòu)象相關(guān)。本研究中，ASIP和AgRP的平均分子量大小基本相等，二者的多肽鏈均表現(xiàn)為親水性。在兩蛋白的理論等電點(diǎn)均值、不穩(wěn)定系數(shù)均值和脂溶指數(shù)均值三個(gè)指標(biāo)中，雖然在數(shù)值上不太一致，但二者的多肽鏈均表現(xiàn)為堿性、不穩(wěn)定和具有脂溶性。值得注意的是，AgRP的理論等電點(diǎn)均值為7.15，接近于中性，且與ASIP的理論等電點(diǎn)均值在數(shù)值上差別較大，具體原因需要進(jìn)一步用試驗(yàn)來驗(yàn)證。二者的多肽鏈同具有脂溶性，說明其在多肽鏈的組成上碳鏈較為豐富。從ASIP和AgRP蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者在結(jié)構(gòu)上具有相似的結(jié)構(gòu)域，但也存在明顯差異。本研究預(yù)測(cè)的ASIP及AgRP蛋白C端三級(jí)結(jié)構(gòu)與Joseph 等[8]對(duì)其結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)存在差異，具體原因可能在于所選取的物種的氨基酸序列或者片段不同，也可能在于所應(yīng)用的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件內(nèi)部參數(shù)的不同所致，具體原因有待于進(jìn)一步更深入全面的研究，同時(shí)還需要結(jié)合相關(guān)的試驗(yàn)來驗(yàn)證。

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BioinformaticsComparativeAnalysisofAgoutiSignalingProteinandAgouti-RelatedProtein

MA Jian-qing1,LI Xiang-long1,2*,ZHOU Rong-yan1,LI Lan-hui1,YANG Qing-fang3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding,Hebei071001,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Changli,Hebei066600,China；3.AnimalDiseasePreventionandControlCenter,XingtaiAgricultureBureau,Xingtai,Hebei054001,China)

The characteristics of the Agouti Signaling Protein (ASIP),the complete coding region (CDS) of Agouti-Related Protein (AgRP) and the corresponding amino acid sequence of 18 species were analyzed through bioinformatic method to explore the genetic characteristics of ASIP and AgRP,and to provide basic data for the energy metabolism of the organism.The results showed that the nucleotide conservative regions of the two kinds of CDS sequence with ASIP and AgRp both being 399 sites were 262 to 399 bp and 230 to 399 bp sites; and all the values of ASIP and AgRP polymorphic sites variation indicators were compared and their percentages were rather close.The numbers of haploid were 22 and 23 for both 46 sequences of ASIP CDS and 32 sequences of AgRP CDS respectively; the evolution and genetic differentiation of ASIP and AgRP were similar.Their amino acid sequence was more conservative in 98-140 aa amino acids segment,and the region was also rich in Cys.Despite of similar three-dimensional structure in the c-terminal,structure specificity of ASIP and AgRP can be observed.

Agouti; ASIP; AgRP; bioinformatics

2013-09-08，

2013-10-14

國家自然科學(xué)基金(31172196)；河北省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)領(lǐng)軍人才培育計(jì)劃(LJRC004)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蛋雞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助

馬建青(1988-)，女，河北邢臺(tái)人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究。E-mail：majianqing2006@126.com

*[通訊作者]李祥龍(1963-)，男，河北豐南人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種研究。E-mail：lixianglongcn@yahoo.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0009-06