劉 暢李宛珊孫路路潘 健藍(lán)海濤

趙 昕1付 征1遠(yuǎn) 庚1何 龍1齊文升1△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053；2.安徽省蚌埠市第一人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 001001）

·研究報(bào)告·

新加達(dá)原散體外延緩銅綠假單胞菌耐藥的實(shí)驗(yàn)研究*

劉 暢1李宛珊1孫路路2潘 健1藍(lán)海濤1

趙 昕1付 征1遠(yuǎn) 庚1何 龍1齊文升1△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京 100053；2.安徽省蚌埠市第一人民醫(yī)院，安徽 蚌埠 001001）

目的 探討新加達(dá)原散體外延緩銅綠假單胞菌耐藥的作用。方法 應(yīng)用血清藥理學(xué)方法制備新加達(dá)原散含藥血清，模擬中藥口服吸收后的實(shí)際成分。采用含藥血清混合肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌ATCC27853，同時(shí)以低濃度左氧氟沙星誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥，對(duì)照組采用空白大鼠血清處理，同時(shí)設(shè)立不含血清的單純抗生素誘導(dǎo)組以除外血清本身的作用。即分為含藥血清組、空白血清組和空白對(duì)照組。隨后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，觀察每一代細(xì)菌生長(zhǎng)及出現(xiàn)耐藥的情況，直至某一組產(chǎn)生細(xì)菌耐藥現(xiàn)象，紙片法測(cè)定3組細(xì)菌耐藥情況的差異，并測(cè)量每組的MIC值。結(jié)果 在體外誘導(dǎo)耐藥的過(guò)程中，誘導(dǎo)至第6代，空白血清組和空白對(duì)照組產(chǎn)生耐藥，誘導(dǎo)至第10代，含藥血清組產(chǎn)生耐藥。結(jié)論 新加達(dá)原散含藥血清體外可以延緩銅綠假單胞菌對(duì)左氧氟沙星耐藥性的產(chǎn)生。

新加達(dá)原散 銅綠假單胞菌 細(xì)菌耐藥

隨著臨床上廣譜抗生素的廣泛使用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。銅綠假單胞菌感染的發(fā)病率、病死率處于較高水平，并且對(duì)超廣譜抗生素的敏感性不斷在下降［1］。多藥耐藥成了銅綠假單胞菌感染的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題，近年來(lái)更是出現(xiàn)了對(duì)除了多粘菌素外的所有抗假單胞菌的抗生素同時(shí)耐藥的菌株，即泛耐藥銅綠假單胞菌。除多粘菌素外目前市面上有售的抗生素對(duì)其完全無(wú)效，患者一旦感染，往往使臨床醫(yī)師束手無(wú)策，病死率極高，造成極其嚴(yán)重的后果［2-3］。中藥在抑制細(xì)菌耐藥方面取得了不少成果，主要是在單味藥和中藥單體的研究上較多。筆者臨床應(yīng)用新加達(dá)原散聯(lián)合抗生素治療耐藥菌感染取得良好效果。本實(shí)驗(yàn)以基于伏邪理論的清透法為處方原理，以新加達(dá)原散制成含藥血清，進(jìn)行含藥血清對(duì)銅綠假單胞菌耐藥的體外實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠100只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)：SCXK（京）2009-0017，在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物房喂養(yǎng)。正常光照條件下，食、水自由攝取，室溫控制在18～22℃。

1.2 菌株 銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室保存）。

1.3 藥物 新加達(dá)原散（青黛、草果、黃芩、蟬衣、柴胡等），由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥劑科提供，配制成含生藥2 g/mL的煎劑，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩楸ＷC不同批次中藥湯劑有效成分的一致性，由筆者所在醫(yī)院藥劑科對(duì)每批煎劑樣本進(jìn)行指紋圖譜分析比照，保證中藥煎劑的一致性。鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20066291，100 mL，0.3 g）。

1.4 試劑與設(shè)備 左旋氧氟沙星藥敏紙片（藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司，規(guī)格：直徑6mm，每片吸水量約20μL，5 μg/片）；M-H肉湯；M-H培養(yǎng)皿；營(yíng)養(yǎng)瓊脂沉降菌培養(yǎng)皿（NA）。全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)；加樣器；超凈工作臺(tái)；離心機(jī)；水浴鍋；溫箱；光電比濁儀；標(biāo)準(zhǔn)比濁管；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；加樣器；吸頭；止血鉗；手術(shù)剪；采血針；采血管；游標(biāo)卡尺等。

2 方 法

2.1 含藥血清制備 將大鼠隨機(jī)分為2.5倍等效劑量灌胃組、空白對(duì)照組兩組。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，分別予中藥或注射用水灌胃。2.5倍等效劑量組根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量成人每日用量折算為5 g/d［4］，將原液稀釋成1.25 g/mL，每日灌胃4 mL，分早晚兩次灌入；空白對(duì)照組以相同體積注射用水灌胃，共5 d，末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血針取血［5］。取血1 h分層后，采血管于4℃恒溫冰箱放置1 h，然后離心機(jī)中3000 r/min離心15 min，取上層清液，同組血清分別混勻后，分裝于1 mL EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 營(yíng)養(yǎng)肉湯制備 稱取37 g肉湯粉溶于1 L蒸餾水中，加熱至煮沸使其完全溶解，再用121℃、15 min高壓滅菌，將肉湯分裝于試管中，置于4℃冰箱無(wú)菌備用。

2.3 菌液制備 將銅綠假單胞菌ATCC27853接種于血培養(yǎng)平皿中，35℃溫箱孵育18～24 h，次日以無(wú)菌接種環(huán)取少量菌落于適量生理鹽水中，用比濁儀對(duì)照后，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU/mL（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?，置?℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 鹽酸左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌ATCC27853的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定在無(wú)菌條件下，用微量加樣器精確移取鹽酸左氧氟沙星注射液500 μL與滅菌注射用水671.875 μL混合稀釋至1280 μg/mL。在96孔板選取12孔，第1孔中加入上述稀釋后的左氧氟沙星溶液20 μL和營(yíng)養(yǎng)肉湯180 μL，第2到第12孔中每孔加入100 μL營(yíng)養(yǎng)肉湯。以加樣器混勻后由第1孔吸取100 μL混勻液至下一孔，繼續(xù)混勻進(jìn)行2倍系列稀釋至第10孔，剩余混勻液棄去，使各孔左氧氟沙星最終質(zhì)量濃度為128、64、 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL，前11孔每孔分別加入配制好的菌液10 μL，第11孔作為陽(yáng)性對(duì)照，第12孔作為陰性對(duì)照。以上操作后，放入35℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后取出，以小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌的MIC值。測(cè)得MIC值后，在MIC濃度上下幾個(gè)稀釋度都取培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)基上，隔夜培養(yǎng)18～24 h后觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最大藥物濃度為鹽酸左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌ATCC27853的MBC值。

2.5 K-B法對(duì)左氧氟沙星藥敏紙片對(duì)銅綠假單胞菌ATCC27853的抑菌環(huán)直徑的測(cè)定 采用紙片擴(kuò)散法（K-B法），將0.5麥?zhǔn)蠁挝汇~綠假單胞菌ATCC27853菌液密涂于4 mm厚的M-H培養(yǎng)皿上，中間貼左氧氟沙星藥敏紙片，35℃溫箱培養(yǎng)18～24 h后游標(biāo)卡尺量取抑菌環(huán)直徑。

2.6 低濃度鹽酸左氧氟沙星體外傳代誘導(dǎo)耐藥的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分為以下3組。含藥血清組：含藥血清＋1/2 MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液。空白血清組：空白血清＋1/2MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液?？瞻讓?duì)照組：1/2MIC濃度左氧氟沙星溶液＋肉湯培養(yǎng)基＋PA ATCC27853菌懸液。

每組中每孔鹽酸左氧氟沙星最終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，血清添加量選擇為整個(gè)反應(yīng)體系的20%，分別將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊你~綠假單胞菌ATCC27853菌液10 μL接種于每孔中，培養(yǎng)18～24 h為1代后，分別由各孔中取適量菌液比濁后配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝?，分別接種于同組的第2孔中，記為第2代，如此重復(fù)傳代，并用傳代后的細(xì)菌做誘導(dǎo)耐藥實(shí)驗(yàn)及K-B法測(cè)左氧氟沙星藥敏紙片對(duì)上一代細(xì)菌的抑菌環(huán)直徑，用肉湯稀釋法測(cè)左氧氟沙星對(duì)上一代細(xì)菌的MIC值，待抑菌直徑判斷為耐藥，且誘導(dǎo)后的MIC值≥4倍誘導(dǎo)前的MIC值，判斷誘導(dǎo)耐藥成功。將判斷為誘導(dǎo)成功的耐藥菌株繼續(xù)傳3代，每代均用K-B法檢測(cè)左氧氟沙星藥敏紙片的抑菌環(huán)直徑，確定耐藥菌株的穩(wěn)定性，比較3組出現(xiàn)耐藥的先后順序及MIC值。

2.7 藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)判定 根據(jù)2009年臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究室（CLSI）的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［6］判讀：左氧氟沙星MIC≥8 μg/mL為耐藥（R），4 μg/mL為中介（I），≤2 μg/mL為敏感（S）；藥敏紙片含5 μg藥物，抑菌直徑≤13 mm為耐藥（R），14～16 mm為中介（I），≥17 mm為敏感（S）。

3 結(jié) 果

3.1 左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌 ATCC27853的MIC、MBC值和抑菌圈直徑 倍比稀釋法測(cè)得鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液對(duì)銅綠假單胞菌ATCC27853的MIC值為2 μg/mL，MBC值為4 μg/mL；K-B法測(cè)定左氧氟沙星藥敏紙片對(duì)銅綠假單胞菌ATCC27853的抑菌圈直徑為24 mm。

3.2 低濃度鹽酸左氧氟沙星體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌ATCC27853耐藥的結(jié)果 在低濃度鹽酸左氧氟沙星體外傳代誘導(dǎo)銅綠假單胞菌耐藥的過(guò)程中，觀察每代銅綠假單胞菌菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，含藥血清組肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)量明顯少于空白血清組和空白對(duì)照組；誘導(dǎo)至第6代，含藥血清組抑菌圈直徑（20.08±0.55）mm，空白血清組抑菌圈直徑（11.58±0.71）mm，空白對(duì)照組抑菌圈直徑（11.25±0.79）mm，空白血清組、空白對(duì)照組菌株抑菌環(huán)直徑＜13.00 mm，MIC值為16 μg/mL，對(duì)左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥，而含藥血清組耐藥性弱于空白血清、空白對(duì)照兩組；誘導(dǎo)至第10代，含藥血清組抑菌圈直徑（12.07±0.35）mm，MIC值為16 μg/mL，對(duì)左氧氟沙星產(chǎn)生耐藥。提示新加達(dá)原散具有延緩低濃度左氧氟沙星環(huán)境下銅綠假單胞菌耐藥性產(chǎn)生的作用。見(jiàn)表1，表2。

表1 肉眼觀察PA ATCC27853各組傳代細(xì)菌生長(zhǎng)情況結(jié)果

表2 PA ATCC27853傳代各組平均抑菌圈直徑（mm）

4 討 論

銅綠假單胞菌是院內(nèi)獲得性感染的重要條件致病菌，可以引起嚴(yán)重的、甚至致死性的感染。隨著耐藥菌不斷出現(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有抗生素不斷耐藥，研發(fā)新型抗生素不僅需要大量資金投入，同時(shí)需要很長(zhǎng)的研發(fā)時(shí)間，而細(xì)菌耐藥菌株的出現(xiàn)卻日新月異，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)抗生素研發(fā)周期。目前從抗生素的不斷升級(jí)、種類的更新，到劑量增加、多類聯(lián)合，仍不能很好地控制耐藥菌感染，而對(duì)于耐藥菌的定植，則無(wú)從治療［7］。銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥是由多因素造成的。細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶；細(xì)菌改變藥物作用的靶位結(jié)構(gòu)；細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性降低；主動(dòng)外排作用；代謝途徑的改變之間可以發(fā)生協(xié)同作用；生物膜銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制也是近年來(lái)的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)［8-9］。銅綠假單胞菌對(duì)不同抗生素的耐藥機(jī)制也不完全相同，可能還不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn)。因此臨床上銅綠假單胞菌出現(xiàn)多重耐藥、交叉耐藥的現(xiàn)象亟待解決。由抗生素應(yīng)用引起的耐藥性問(wèn)題，促使國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界把注意力轉(zhuǎn)向具有抗菌活性的中草藥，不少研究顯示中藥不但具有抗菌活性，中藥復(fù)方的使用能加強(qiáng)抗菌活性甚至具有逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥的作用［10］。

中藥在抑制細(xì)菌耐藥方面有不少實(shí)驗(yàn)報(bào)道。張淑文等［11-16］總結(jié)若干中藥對(duì)耐藥菌干預(yù)作用的研究，篩選出多種具有抑制細(xì)菌耐藥性的中藥組成復(fù)方清熱顆粒，并將其驗(yàn)證于實(shí)驗(yàn)及臨床，效果頗著。劉清泉等［17-20］也做過(guò)類似的研究，其根據(jù)中醫(yī)伏邪理論提出扶正透邪溫陽(yáng)是中醫(yī)藥治療耐藥菌感染的治則，在耐藥菌感染治療上應(yīng)用抗生素聯(lián)合扶正透邪方，臨床上取得良好的效果，并且在體內(nèi)體外耐藥菌實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)中藥對(duì)細(xì)菌耐藥性的良性干預(yù)作用。

筆者在臨床觀察和治療耐藥菌感染中發(fā)現(xiàn)耐藥菌感染符合伏邪致病的特點(diǎn)，治療伏邪溫病，不可過(guò)用苦寒，當(dāng)以清透為主，據(jù)此建立了以清透法為制方原理的新加達(dá)原散，聯(lián)合抗生素治療耐藥菌感染，在臨床治療中收效頗著。本實(shí)驗(yàn)體外誘導(dǎo)耐藥模型的方法為低濃度抗生素微量肉湯稀釋傳代誘導(dǎo)法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示含藥血清組出現(xiàn)耐藥的時(shí)間較空白血清組和空白對(duì)照組晚，提示在誘導(dǎo)劑左氧氟沙星的作用下，含藥血清的加入干預(yù)了銅綠假單胞菌的耐藥性，在一定程度上延緩銅綠假單胞菌出現(xiàn)耐藥的時(shí)間。該實(shí)驗(yàn)最大限度地模擬了中西藥結(jié)合治療細(xì)菌感染的體內(nèi)狀態(tài)。

耐藥菌感染患者多表現(xiàn)正氣虧虛，易受外邪侵襲，若治不得法，過(guò)用寒涼藥物、過(guò)早使用下法等，會(huì)導(dǎo)致邪氣不除，漸行入里，伏藏于內(nèi)，伏久郁而化熱，遇時(shí)而發(fā)。故邪氣潛伏，必須透達(dá)。清透法的代表方劑為達(dá)原飲，吳又可在解釋方名時(shí)說(shuō)“檳榔能消能散，除伏邪，為疏利之藥；厚樸破戾氣所結(jié)，草果辛烈氣雄，除伏邪盤(pán)踞；三味協(xié)力，直達(dá)其巢穴，使邪氣潰敗，速離膜原，是以為達(dá)原也”。因此伏邪理論獨(dú)特的清透法在臨床耐藥菌感染的治療中有著不可替代的療效價(jià)值。我科繼承蒲輔周、薛伯壽老中醫(yī)的經(jīng)驗(yàn)，整合中醫(yī)治療傷寒、溫病的優(yōu)勢(shì)，在薛伯壽老中醫(yī)的指導(dǎo)下，在達(dá)原飲的基礎(chǔ)上加減組成新加達(dá)原散。該方是由達(dá)原飲、升降散、小柴胡湯加減化裁而來(lái)，以青黛解毒；乳香散癖結(jié)；草果外達(dá)潛伏之邪；黃芩、柴胡和解表里；蟬衣、酒軍升清降濁、調(diào)和紊亂之氣血。全方具有清熱涼血、解毒透邪之功效。

通過(guò)前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示以清透法為制方原理的新加達(dá)原散含藥血清體外可以延緩銅綠假單胞菌對(duì)左氧氟沙星出現(xiàn)耐藥的時(shí)間，這無(wú)疑為中醫(yī)藥解決細(xì)菌耐藥這一棘手難題提供了思路。

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Study on Bacteriostasis of Pseudomonas Aeruginosa by Xinjiadayuan Decoction in Vitro

LIU Chang1，LI Wanshan2，SUN Lulu2，et al. 1 Guang′anmen Hospital，China Academy of Chinese Medicine Science，Beijing 100053，China；2 Bengbu First People's Hospital，Anhui Province，Anhui，Bengbu 001001，China

Objective：To study the role of inhibiting antibiotic resistance by Xinjiadayuan Decoction.Methods：Serum pharmacology method was applied to prepare drug serum to simulate the actual compounds after oral medicine absorbed.The pseudomonas aeruginosa ATCC27853 was cultured in broth medium with drug serum. Resistance of PA was induced by low concentration levofloxacin.Control group was treated by blank rat serum.At the same time，a group cultured PA in broth medium with simple antibiotics without serum was set up to remove the interference of serum itself.During subculture，culture of bacteria of each generation was observed until drug resistance occurred.Kirby-Bauer method was used to measure the antibiotic sensitivity and MIC was measured in each group.Results：In the process of induction of resistance in vitro，the blank serum group and blank control group were resistant in the sixth generation.While medicated serum group were resistant in the tenth generation. Conclusion：Serum containing Xinjiadayuan Decoction may delay the resistance of PA to levofloxacin.

Xinjiadayuan Decoction；Pseudomonas Aeruginosa；Bacterial resistance

R285.5

A

1004-745X（2014）11-2017-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.021

2014-07-23）

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院科研課題項(xiàng)目（2009-S219）

△通信作者