曹 婷，施力光，張立嶺，周漢林，荀文娟，侯冠彧*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737;2.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 海口 570228)

五指山豬與長白豬妊娠期65d豬胎兒肌纖維差異比較研究

曹 婷1，施力光1，張立嶺2，周漢林1，荀文娟1，侯冠彧1*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737;2.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，海南 ?？?570228)

為尋找五指山豬與長白豬肌肉發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期(妊娠期65d)肌纖維發(fā)育差異情況，采用石蠟切片、HE染色、Image-Pro Plus軟件測量及SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析多種技術(shù)對兩豬種骨骼肌肌纖維的表觀組織學(xué)特征、數(shù)目和橫截面積差異進(jìn)行分析。結(jié)果表明，五指山豬和長白豬妊娠期65 d胎兒肌纖維組織學(xué)外觀有明顯差異；并且長白豬豬胎兒骨骼肌肌纖維數(shù)目和橫截面積均顯著高于五指山豬(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果確定兩豬種肌肉發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期肌纖維發(fā)育差異，為日后深入研究影響肌肉發(fā)育的機(jī)制提供了參考。

五指山豬；長白豬；妊娠期65 d；骨骼肌; 肌纖維

五指山豬，又稱老鼠豬、五腳豬，系脊椎動物門、哺乳綱、偶蹄目、豬科、豬屬，主要產(chǎn)于海南省五指山地區(qū)。其體型矮小、細(xì)致緊湊，四肢短細(xì)，頭耳尖小，胸窄背直，腹垂臀實(shí)，靈敏善動，身覆黑或棕色毛皮，是中國的著名小型豬種之一[1]。五指山豬與人類在生理、病理及解剖學(xué)上有很大的相似，所以是較好的科研模式動物。而且其具有遺傳性穩(wěn)定，抗逆性強(qiáng)，代謝率低，皮薄膘少，肉質(zhì)好，氨基酸和脂肪酸豐富等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，是雜優(yōu)豬的理想選育品種。中國的地方豬具有肉感細(xì)膩，味道鮮美，細(xì)嫩多汁等美譽(yù)，但是生長速度緩慢、飼養(yǎng)成本大等不足導(dǎo)致很多優(yōu)良的地方豬種已經(jīng)消失或?yàn)l臨滅絕，五指山豬就是面臨以上問題的豬種之一，曾在2000年被列入《國家級畜禽品種資源保護(hù)名錄》，并被收錄于《中國生物多樣性國情研究》成為國家二類重點(diǎn)保護(hù)動物[1]。長白豬則原產(chǎn)于丹麥，具有生長速度快、屠宰率高、胴體瘦肉率高、屠體較長等優(yōu)點(diǎn)，但是存在肉質(zhì)欠佳、抗逆性差、對飼料要求高等缺點(diǎn)和不足[3]。隨著社會生活水平的不斷提高和進(jìn)步，生長率和瘦肉率的提高成為豬的養(yǎng)殖和培育上的重點(diǎn)，但是在目的性的選育過程中難免會降低其肉品質(zhì)的保證，所以越來越多的肉品質(zhì)優(yōu)化問題變得日益顯著起來[4]。

肌肉的生長發(fā)育和肉品質(zhì)性狀的形成是優(yōu)良豬種選育和肉品質(zhì)改良的研究重點(diǎn)。豬胎兒時(shí)期肌纖維的形成和發(fā)育是影響其出生后肌肉發(fā)育好壞和肉品質(zhì)高低的關(guān)鍵[5-6]。組成肌肉的主要成分是肌纖維，肌纖維的大小和數(shù)量直接影響出生后產(chǎn)肉量的多少，肌纖維的數(shù)目在胎兒期就已經(jīng)決定，出生后肌纖維數(shù)目不變，只是肌纖維的體積增長[7-9]，不同的豬種在肌纖維的數(shù)目和橫截面積上都有著一定的差異[8,10-11]，因此研究肌纖維的數(shù)目和大小在探索肌肉生長發(fā)育差異上起很大的作用。研究證實(shí)，中國地方豬種肌纖維數(shù)目一般比西方瘦肉豬少且肌纖維比較細(xì)[4,10]。然而導(dǎo)致以上差異的因素有多種，如：遺傳、環(huán)境、性別、信號通路都有密切的聯(lián)系[8,12]。

本研究基于五指山豬生長緩慢、體型矮小但肉品質(zhì)好等特點(diǎn)，與生長速度快、瘦肉率高、但抗逆性差、肉質(zhì)欠佳并對飼料要求偏高的商用西方長白豬做實(shí)驗(yàn)對比，對其肌肉發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的胎兒肌纖維組織學(xué)進(jìn)行分析。探索其肌肉發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期(妊娠期65 d)肌纖維發(fā)育的差異與出生后產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，為肉品質(zhì)的改良和優(yōu)良種豬的選育提供可靠的試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所實(shí)驗(yàn)豬場飼養(yǎng)的妊娠期65 d的五指山豬和長白豬母豬各2頭，快速處死，將胎盤取出，各豬種隨機(jī)選取16頭胎兒，采集其背部骨骼肌組織，放入4%多聚甲醛固定液中備用。

1.2 主要試劑和儀器材料

磷酸緩沖液-PBS、4%多聚甲醛固定液、酸醇、斯科特自來水、醇溶伊紅、中性樹脂、蘇木精、乙醇、二甲苯等(自配或購于試劑公司)。LS-2055A輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)及烘片機(jī)(沈陽龍首電子儀器有限公司)，DHG-9246A烘箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沖洗、固定 取新鮮組織，用磷酸緩沖液清洗，鋒利刀片修成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm小塊，自制紗布包包好分別放入4%多聚甲醛固定24 h。

1.3.2 浸洗、脫水和透明 用磷酸緩沖液充分浸洗替換出固定液，依次移入50%、70%、80%、95%、95%、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、乙醇/二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1 h至組織塊透明。

1.3.3 浸蠟、包埋、修蠟塊 在60 ℃烘箱中浸蠟3～4 h，用充分熬制和排氣泡完全的蠟液和自制包埋用紙盒進(jìn)行包埋，冷卻，用鋒利刀片修成適當(dāng)大小的梯形。

1.3.4 切片、展片、烤片 切片厚度保持在4～5 μm，在40 ℃溫水中充分展片，輕撈至載玻片上40 ℃烘片機(jī)上烘干，在60 ℃烘箱內(nèi)烘烤2～3 h(使切片緊密粘合，防止脫片)。

1.3.5 染色 二甲苯Ⅰ 15′→二甲苯Ⅱ 15′→無水乙醇Ⅰ 2′→無水乙醇Ⅱ 2′→95%乙醇 2′→85%乙醇 2′→70%乙醇 2′→50%乙醇 2′→蒸餾水 1′→蘇木精 11′→蒸餾水 2′ →鹽酸酒精(酸醇，自配)70〞→斯科特自來水(自配)15′→50%乙醇 3′→75%乙醇 3′→90%乙醇 3′→95%乙醇 3′→醇溶伊紅7′30〞→95%乙醇 3′→95%乙醇 3′→95%乙醇 3′→無水乙醇Ⅰ 5′→無水乙醇Ⅱ 5′→二甲苯Ⅰ 8′→二甲苯Ⅱ 8′→封片→觀察、攝取圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Image-Pro Plus軟件中的Measure→Measurements將HE染色圖片進(jìn)行肌纖維計(jì)數(shù)和表面積測量。SAS軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩豬種65 d胎兒肌纖維表觀差異

結(jié)果顯示：經(jīng)過石蠟切片HE染色的五指山豬和長白豬胎兒肌纖維在表觀觀察上有明顯差異：五指山豬胎兒肌纖維之間界限模糊不清且肌纖維邊緣不圓整，不易區(qū)分肌纖維數(shù)目和大?。欢L白豬胎兒肌纖維之間界限清晰且肌纖維邊緣圓整，能方便分出和辨別肌纖維數(shù)目和大小；五指山豬胎兒骨骼肌纖維細(xì)胞核分布位置主要集中在肌纖維周緣，而長白豬胎兒骨骼肌纖維細(xì)胞核主要分布在肌纖維中部。這些差異的出現(xiàn)都有可能是導(dǎo)致兩豬種出生后產(chǎn)肉性能和肉品質(zhì)差異的關(guān)鍵因素。結(jié)果見圖1。

圖1 五指山豬與長白豬妊娠65 d胎兒骨骼肌組織HE染色結(jié)果(×200)Fig.1 HE staining in skeletal muscle of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days(×200)

2.2 兩豬種65 d胎兒肌纖維數(shù)目和橫截面積差異

五指山豬與長白豬65d胎兒背肌纖維的數(shù)目及面積結(jié)果見表1。由表1可知，五指山豬65 d胎兒背部肌纖維數(shù)目顯著少于長白豬65 d胎兒背部肌纖維數(shù)目(P<0.05)；長白豬65 d胎兒肌纖維橫截面積顯著大于五指山豬65 d胎兒骨骼肌肌纖維橫截面積(P<0.05)。這些差異為進(jìn)一步深入探討肌肉發(fā)育機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

表1 五指山豬與長白豬65 d胎兒背期肌纖維的數(shù)目和面積Table 1 Number and cross sectional area of Myofiber of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days

注：同列肩標(biāo)小寫字母不同表示顯著差異(P<0.05)。

Notes: Different superscripts in the same column indicates the significant difference (P<0.05).

3 討 論

肌肉的生長和肉品質(zhì)性狀的形成是一個(gè)漫長而又復(fù)雜的分子遺傳生物學(xué)過程，影響肌肉發(fā)育和肉品質(zhì)形成的因素有很多。本試驗(yàn)以外觀、表型差異顯著的中國地方小型豬的代表-五指山豬，和西方瘦肉型豬的代表-長白豬作為研究對象，對肌肉發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期肌纖維的差異進(jìn)行研究分析。為實(shí)現(xiàn)五指山豬的實(shí)驗(yàn)動物化、優(yōu)良豬種的選育、肉品質(zhì)的優(yōu)化提升以及日后深入探索打下有力的理論基礎(chǔ)，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會意義。

肌纖維的數(shù)目、大小和骨骼肌中肌細(xì)胞的數(shù)量直接決定骨骼肌的發(fā)育情況和機(jī)體的產(chǎn)肉量，肌纖維發(fā)育的差異對肌肉發(fā)育和肉品質(zhì)的不同起著重要的決定作用[5,13-15]。肌纖維的發(fā)育過程從胚胎期開始，可概括為：多能胚胎干細(xì)胞→中胚層細(xì)胞→單核成肌細(xì)胞→肌纖維 (肌管融合肌細(xì)胞)，出生后肌纖維數(shù)目不會在改變，但肌纖維的體積會增大[16-17]，因此研究胎兒期肌纖維數(shù)量和大小的差異來探討肌肉發(fā)育差異和肉質(zhì)性狀的不同具有很重要的研究意義。肌纖維的數(shù)目對日后肌肉發(fā)育的調(diào)控作用起著至關(guān)重要的作[18]。經(jīng)研究得出，豬的肌纖維形成的主要過程是在妊娠期14 d到100 d，且有兩個(gè)生長波，分別是30 d到60 d的第一個(gè)生長波和54 d到90 d的第二個(gè)生長波[9,18]，因此為了探索豬胎兒骨骼肌形成和豬種間生長差異機(jī)理，科研人員已經(jīng)把注重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到關(guān)鍵發(fā)育時(shí)期研究其差異機(jī)制。

本研究選擇五指山豬和長白豬妊娠期第二生長波范圍內(nèi)的65 d豬胎兒背部骨骼肌進(jìn)行切片表觀觀察，并利用Image-Pro Express 6.0、SAS等軟件對肌纖維進(jìn)行數(shù)量和橫截面積的測量、計(jì)算和比較。通過觀察，可以看到五指山豬和長白豬妊娠期65 d豬胎兒骨骼肌肌纖維在表觀觀察上存在明顯差異，五指山妊娠期65 d豬胎兒骨骼肌肌纖維之間界限模糊不清，且肌纖維邊緣不圓整，不易辨別肌纖維數(shù)目和大??；而妊娠期65 d長白豬胎兒骨骼肌肌纖維卻相反，其肌纖維之間界限清晰且肌纖維邊緣圓整，易分辨肌纖維數(shù)目和大小。此外，細(xì)胞核的分布也有明顯差異。與此同時(shí)，這兩種豬胎兒骨骼肌纖維在數(shù)目和橫截面積的大小上也有顯著差異即：五指山豬65 d胎兒背部肌纖維數(shù)目顯著少于長白豬65 d胎兒背部肌纖維數(shù)目；長白豬65 d胎兒背部肌纖維橫截面積顯著大于五指山豬65 d胎兒骨骼肌肌纖維橫截面積。并且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果與多個(gè)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)西方的瘦肉型豬的肌纖維數(shù)比中國的地方豬的要多，且肌纖維粗這一結(jié)果一致[4,10]，在一定程度上證實(shí)了中國地方豬與西方瘦肉型豬在肌肉發(fā)育上存在的普遍差異點(diǎn)，為日后研究豬種改良和肉品質(zhì)提升提供研究依據(jù)點(diǎn)。

本試驗(yàn)沒有對不同豬種間其他胎兒階段的肌纖維特征作對比，因此不能斷定該階段(妊娠期65 d)是否為不同豬種間肌肉發(fā)育差異最大的時(shí)間點(diǎn)。但是研究結(jié)果表明在妊娠期65 d的五指山豬和長白豬豬胎兒肌纖維組織無論在表觀上還是分布、大小和數(shù)目上都有顯著差異(P<0.05)。這一結(jié)果足以為日后分析不同豬種間肌肉發(fā)育差異和肉品質(zhì)差異的作用機(jī)制和控制因素研究提供重要實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和分析依據(jù)。

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ResearchontheSignificantDifferenceoftheMyofiberofWuzhishanandLandracePigin65dFetalPeriod

CAO Ting1,SHI Li-guang1,ZHANG Li-ling2,ZHOU Han-lin1,XUN Wen-juan1,HOU Guan-yu1*
(1.TropicalCropsGeneticResourcesInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementinSouthernChina,MinistryofAgriculture,China,HainanDanzhou571737;2.CollegeofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,570228)

With the back skeletal muscle of Wuzhishan pig and Landrace pig in fetal period of 65 days as the experimental materials,HE staining,Image-Pro Plus,SAS technology,et al.were applied to analyze the significant difference of the myofiber at the critical period in muscle development (in fetal period at 65 days).The results showed that the number and the cross sectional area of Myofiber of Wuzhishan and Landrace pig in fetal period at 65 days revealed significant difference on the observation in appearance,and the Landrace pig was with higher number and the bigger cross sectional area of Myofiber than that of Wuzhishan pig (P<0.05).

Wuzhishan pig;Landrace pig;fetal period at 65 days;skeletal muscle;myofiber

2013-12-06，

2014-01-08

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院中央及公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630032013020)；海南省自然科學(xué)基金(311071)；家養(yǎng)動物種質(zhì)資源平臺項(xiàng)目資助

曹 婷(1987-)，女，吉林人，碩士，從事家畜遺傳資源研究。E-mail:jilincaoting@126.com.

*[通訊作者]侯冠彧(1975-)，男，內(nèi)蒙通遼人，博士，副研究員，從事家畜遺傳資源研究。E-mail: guanyuhou@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)07-0037-04